Oct 23, 2023
Un NPAS4
Nature volume 614, pages
Natura volume 614, pagine 732–741 (2023) Citare questo articolo
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L'attività neuronale è fondamentale per il rimodellamento del circuito adattivo, ma rappresenta un rischio intrinseco per la stabilità del genoma durante la lunga durata della vita dei neuroni postmitotici1,2,3,4,5. Non è noto se i neuroni abbiano acquisito meccanismi specializzati di protezione del genoma che consentono loro di resistere a decenni di stimoli potenzialmente dannosi durante periodi di intensa attività. Qui identifichiamo un meccanismo di riparazione del DNA dipendente dall'attività in cui una nuova forma del modificatore della cromatina NuA4-TIP60 si assembla in neuroni attivati attorno al fattore di trascrizione inducibile specifico per i neuroni NPAS4. Purifichiamo questo complesso dal cervello e dimostriamo le sue funzioni nel suscitare cambiamenti attività-dipendenti nei trascrittomi e nei circuiti neuronali. Caratterizzando il panorama delle rotture del doppio filamento del DNA indotte dall'attività nel cervello, mostriamo che NPAS4-NuA4 si lega a elementi regolatori danneggiati in modo ricorrente e recluta ulteriori macchinari di riparazione del DNA per stimolare la loro riparazione. Gli elementi regolatori genici legati da NPAS4-NuA4 sono parzialmente protetti dall'accumulo dipendente dall'età di mutazioni somatiche. La segnalazione compromessa di NPAS4-NuA4 porta a una cascata di difetti cellulari, comprese risposte trascrizionali attività-dipendenti disregolate, perdita di controllo sull'inibizione neuronale e instabilità del genoma, che culminano tutti nella riduzione della durata della vita dell'organismo. Inoltre, è stato segnalato che le mutazioni in diversi componenti del complesso NuA4 portano a disturbi dello sviluppo neurologico e dello spettro autistico. Insieme, questi risultati identificano un complesso neuronale specifico che associa l’attività neuronale direttamente alla conservazione del genoma, la cui interruzione può contribuire a disturbi dello sviluppo, neurodegenerazione e invecchiamento.
L'esperienza sensoriale è essenziale per una corretta maturazione neuronale e la plasticità del circuito1. Le cascate di segnalazione avviate dall'attività neuronale guidata dall'esperienza culminano nell'induzione di programmi genetici che controllano diversi processi come la crescita dei dendriti e delle sinapsi, l'eliminazione delle sinapsi, il reclutamento della neurotrasmissione inibitoria e la mielinizzazione adattativa6,7. Tuttavia, l’attività neuronale minaccia anche l’integrità genomica dei neuroni postmitotici che devono sopravvivere per tutta la vita di un organismo. Ad esempio, l’aumento delle richieste metaboliche durante periodi di elevata attività può aumentare il danno ossidativo alle regioni attivamente trascritte del genoma8. La stessa trascrizione indotta dall'attività rappresenta un'ulteriore minaccia per la stabilità del genoma, poiché è stata collegata all'induzione di ripetute rotture del doppio filamento del DNA (DSB) in elementi regolatori, come i promotori di geni inducibili dallo stimolo2,3,4,5 ,9,10. Sebbene l'accoppiamento della trascrizione con le rotture del DNA sia osservato in tutti i tipi di cellule, questo processo rappresenta una sfida specifica per i neuroni a lunga vita, che non possono utilizzare percorsi di riparazione del DNA dipendenti dalla replicazione e possiedono meccanismi rigenerativi limitati per sostituire le cellule danneggiate11. L'accumulo di danni al DNA nei genomi neuronali è una caratteristica fondamentale dei disturbi neurodegenerativi e dell'invecchiamento dell'organismo12,13. Pertanto, la comprensione delle strategie utilizzate dai neuroni per prevenire e riparare i danni può avere una traduzione diretta nella longevità umana e nelle terapie per l’invecchiamento. Finora non esistono esempi di macchinari di riparazione neuronali specifici che riducano i rischi di instabilità del genoma durante un’attività intensa. Investigando le caratteristiche del programma trascrizionale attività-dipendente specifico dei neuroni, scopriamo un accoppiamento biochimico tra l'attività neuronale e la riparazione del DNA attraverso una forma precedentemente sconosciuta del complesso rimodellatore della cromatina NuA4-riparazione del DNA che si assembla attorno al fattore di trascrizione inducibile specifico per i neuroni NPAS4.
A differenza della maggior parte dei fattori di trascrizione inducibili dall'attività, che sono ampiamente espressi e indotti da vari stimoli, NPAS4 è espresso selettivamente nei neuroni in seguito alla segnalazione del calcio indotta dalla depolarizzazione della membrana14. Per comprendere le funzioni di questo fattore, che è specificamente in sintonia con l’attività neuronale, abbiamo cercato di purificare i complessi proteici contenenti NPAS4 dal cervello di topo adulto. Abbiamo pensato che NPAS4 potrebbe assemblarsi in un complesso multisubunità che espande le sue attività biochimiche nei neuroni attivati. Utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale e l'elettroforesi su gel non denaturante, abbiamo osservato che NPAS4 risiede in un complesso ad alto peso molecolare di circa 1 MDa. Poiché la dimensione prevista di NPAS4 con uno dei suoi partner eterodimeri (ARNT1 e ARNT2) è di circa 175 kDa, questa scoperta suggerisce che NPAS4 interagisce con più partner proteici sconosciuti (Dati estesi Fig. 1a).
0, adjusted P < 0.1 and that are within Q4 of NPAS4 IgG-normalized CUT&RUN signals are indicated in blue. Right inset, IGV tracks of aggregate sBLISS-seq (n = 8 individual mice) and NPAS4 CUT&RUN (n = 5 pools of 3–5 mice) at Cgref1 and Rgs7bp promoters. Coloured bars represent statistically defined peaks. f, Aggregate plots showing sBLISS-seq coverage (fragment depth per bp per peak) at activity-inducible regulatory elements, subset by quartiles of NPAS4 binding. Signals are mean ± s.e.m. (n = 8 individual mice). ***P < 2.2 × 10−16. P values were calculated using the average signal extracted in a 500 bp window around the element centre using unpaired, two-tailed Wilcoxon rank-sum tests./p> Cre). b, Line plot depicting average ± s.e.m. of sBLISS-seq normalized counts in Cre-infected or ΔCre-infected hippocampi of Npas4fl/fl mice, subset by quartiles of NPAS4 binding. Q1 = 1,017 sites, Q4 = 764 sites. Data from n = 5 each for Cre-infected and ΔCre-infected mice. ***P < 2.2 × 10–16. P values were calculated using unpaired, one-tailed Wilcoxon rank-sum tests (Cre > ΔCre). See Extended Data Fig. 12a for boxplot distribution of data. c, Genome-wide breaks in hippocampal nuclei isolated from Npas4fl/fl (n = 5) or wild-type (n = 3) mice infected with Cre or ΔCre virus. Data are mean ± s.e.m. Npas4fl/fl: 0 h, P = 5.24 × 10–6; 2 h, P = 0.044; 10 h, P = 0.022. Wild-type: 2 h, P = 0.906. P values were calculated using two-tailed, unpaired t-tests. d, Collection of hippocampal neuronal nuclei across lifespan. e,Normalized mutation frequency at NPAS4-bound and unbound sites in wild-type mice. Mutation frequency (base changes and insertions and deletions) with age was calculated per site and normalized to the median frequency for that site in young animals. Points represent the normalized rate for one site sampled from one mouse. Data are mean ± s.e.m. Data are from n = 4 (young), 4 (middle aged) and 3 (old) mice. No NPAS4 sites: mid–young, *P = 0.03; old–young, *P = 0.016. NPAS4-bound sites: mid–young, NS = 0.18; old–young, **P = 0.0095. P values calculated using one-tailed, unpaired t-tests. f, Survival of Npas4 wild-type (n = 53; 28 females, 25 males) and Npas4 knockout (n = 64; 37 females, 27 males) mice, showing abbreviated lifespan of Npas4 knockout mice. P = 4.09 × 10–13 by a two-tailed Mantel–Cox test, P = 3.63 × 10–11 by a two-tailed Gehan–Breslow–Wilcoxon test./p>/J (Jackson Laboratory, 021039)53; and B6.Cg-Tg(Camk2a-cre)T29-1Stl/J (Jackson Laboratory, 005329)54. Mice were housed in a temperature and humidity-controlled environment using ventilated microisolator cages. Mice were kept under a standard 12 h light–dark cycle, with food and water provided ad libitum. Male and female littermate mice were used in similar proportions and divided between control and experimental groups for all experiments conducted. No statistical methods were used to predetermine sample sizes. For biochemistry and genomic experiments, animals were collected at 4–6 weeks of age throughout the manuscript. For physiology experiments, animals were dissected and patched at postnatal day 24 (P24) to P28. For ageing experiments, animals were collected at 3-4 months, 12 months and 23–27 months of age. Details of animal age and sex are detailed within each protocol./p>30% infected CA1 pyramidal neurons were not used for recordings. Slices were also discarded if Cre-mCherry expression was observed in the CA3 or dentate gyrus regions./p>25 KU (1 µl per 10 million nuclei)) followed by the addition of NaCl to a final concentration of 300 mM. Following high-speed centrifugation to remove insoluble material, lysates were diluted to achieve a final salt concentration of 200 mM. To preclear nonspecific interactions, lysates were incubated for 30 min at 4 °C with 50 µl of ms-IgG-coated agarose beads (Sigma-Aldrich, A0919). Following preclear, lysates were incubated for 1.5 h with 60 µl of anti-M2-Flag resin (Sigma-Aldrich, A2220) per 1 ml of diluted lysate. Samples were washed 4× in NE1 buffer containing 250 mM NaCl for 5 min with rotation at 4 °C. NPAS4-interacting or ARNT2-interacting proteins were competitively eluted off M2 resin by incubation in 50–100 µl of 500 µg ml–1 3× Flag peptide (Sigma-Aldrich, F4799) diluted in NE1 buffer for 30 min at room temperature. For mass spectrometry analysis, eluted proteins were precipitated with trichloroacetic acid. Replicates shown in Fig. 1c consisted of 3 independent pools of 8–12 mice collected from wild-type or Npas4–FH lines and processed on separate days. Validation immunoprecipitation assays using either Npas4–Flag-HA mice or Tip60-H3F mice followed by immunoblotting analysis were conducted under the same conditions as described above. For validation experiments in mouse visual cortex following light stimulation, 20 hippocampi were isolated from the V1 cortices of Npas4–Flag-HA or wild-type controls. Mice were housed in the dark for 1 week followed by 2 h of light stimulation. Data are shown in Extended Data Fig. 1f./p> 1 were removed from further analysis. The voom and limma (edgeR_3.28.1;limma_3.42.2) analysis software packages were used to quantify differential gene expression (requiring FDR-corrected q < 0.01). For analysis of the paired RNA-seq samples that matched sBLISS-seq, the DeSeq2 package was used to generate normalized counts. After running a standard DeSeq2 pipeline, normalized counts were generated with the function counts(dds, normalized=TRUE)59./p>100. For information on primer pooling and the amplicons included in the final analysis, see Supplementary Table 5./p>A/(G>T)) divided by the total number of the given base included in the amplicon. Because it is not possible to know on which strand a mutation occurred, complementary base changes were collapsed into a single category (for example, C>T was combined with G>A). Insertion and deletion frequency was also calculated as a separate category. We also calculated a per amplicon normalized mutation rate in which we divided the total mutation rate for each animal by the median total mutation frequency in young mice. For ageing gradient samples, wild-type mice aged 3 months old were considered young, 12 months old were considered middle aged and 23–27 months old were considered old. Extreme outlier points of both normalized mutation frequency and non-normalized frequency were removed across all samples using a ROUT's test at 0.1% confidence (Fig. 5e and Extended Data Fig. 13g). Outlier removal and statistical tests on mutational samples were performed in Prism (v.8.4.2)./p> 
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