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Apr 30, 2023

I protocolli di dissociazione della mucosa intestinale influenzano le proporzioni del tipo di cellula e il singolo

Scientific Reports volume 12,

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 9897 (2022) Citare questo articolo

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Il sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq) ha rivoluzionato lo studio del paesaggio cellulare degli organi. La maggior parte dei protocolli a cellula singola richiedono materiale fresco, che limita la dimensione del campione per esperimento e, di conseguenza, introduce effetti batch. Ciò è particolarmente vero per i campioni acquisiti attraverso procedure mediche complesse, come le biopsie della mucosa intestinale. Inoltre, la procedura di dissociazione dei tessuti richiesta per ottenere singole cellule è una delle principali fonti di rumore; diverse procedure di dissociazione applicate a diversi compartimenti del tessuto inducono differenze di espressione genica artificiale tra sottoinsiemi di cellule. Per superare queste sfide, abbiamo sviluppato un protocollo di dissociazione in un’unica fase e ne abbiamo dimostrato l’uso su biopsie della mucosa intestinale crioconservate. Utilizzando la citometria a flusso e l'analisi scRNA-seq, abbiamo confrontato questo protocollo di dissociazione in una fase con l'attuale gold standard, la digestione della collagenasi in due fasi e un adattamento di un'alternativa recentemente pubblicata, la digestione della proteasi Bacillus licheniformus attiva a freddo in tre fasi. Sia la vitalità cellulare che la composizione del tipo cellulare erano paragonabili tra la dissociazione della collagenasi in una sola fase e quella in due fasi, con la prima più efficiente in termini di tempo. La digestione fredda della proteasi ha prodotto una pari vitalità cellulare, ma preserva meglio i tipi di cellule epiteliali. Di conseguenza, per analizzare i tipi di cellule più rari, come le cellule gliali, è necessario un numero totale di cellule bioptiche maggiori come materiale di input. I protocolli a più fasi hanno influenzato i tipi di cellule che si estendono su più compartimenti in modo diverso. In sintesi, mostriamo che le biopsie della mucosa intestinale crioconservate possono essere utilizzate per superare le sfide logistiche e gli effetti batch negli ampi studi su scRNA-seq. Inoltre, dimostriamo che l'utilizzo di biopsie crioconservate digerite utilizzando un protocollo di collagenasi in un unico passaggio consente scRNA-seq, FACS, generazione di organoidi e espansione dei linfociti intraepiteliali su larga scala.

Anche se sono passati più di 30 anni da quando il primo cDNA è stato estratto da una singola cellula1, è solo di recente che gli sviluppi tecnologici nel campo del sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) consentono la profilazione dell’espressione genica a singola cellula in modo ad alto rendimento2. Questo sviluppo consente lo studio imparziale di popolazioni cellulari eterogenee all'interno dei tessuti senza la necessità di isolare separatamente i tipi di cellule. Oltre a mappare l'espressione cellulare, ciò consente di studiare le potenziali interazioni cellula-cellula nel contesto di un tessuto3.

Sono in corso numerosi sforzi a livello mondiale per mappare il corpo umano con la risoluzione di una singola cellula sia nella salute (Human Cell Atlas4) che nella malattia (consorzio LifeTime5). Uno dei campi in cui si stanno già compiendo grandi sforzi è quello della gastroenterologia; sono (attualmente in corso) generati atlanti intestinali "sani" fetali, pediatrici e adulti6,7. Ciò ha portato all'identificazione di nuovi tipi di cellule e delle loro funzioni specifiche, come le cellule epiteliali BEST4 coinvolte nella rilevazione del pH8, e ha fornito i primi indizi sul motivo per cui alcuni pazienti con malattia di Crohn non rispondono a farmaci specifici9.

La mucosa intestinale è un organo complesso che può essere suddiviso in più compartimenti: lo strato epiteliale, situato nella parte luminale; e lo strato della lamina propria, che giace sotto l'epitelio. Ciascun compartimento è composto da una miscela di tipi cellulari, che possono avere funzioni specializzate e locali e che sono distribuiti in modo differenziale nel tratto gastrointestinale10,11. Sul lato luminale, la mucosa intestinale è composta da uno strato di muco acellulare, che separa i batteri intestinali dall’epitelio. Questo strato funziona come una seconda barriera tra il mondo esterno e il compartimento intestinale interno. Direttamente sotto si trova lo strato epiteliale, in cui le cellule immunitarie si infiltrano e svolgono funzioni specifiche per la difesa antimicrobica e la segnalazione dell'antigene. Una di queste popolazioni di cellule immunitarie che risiede solo qui è la popolazione di linfociti intraepiteliali (IEL), che è funzionalmente diversa dai linfociti nella lamina propria (LPL), lo strato sottostante. Quest'ultimo strato contiene anche altre cellule immunitarie, sistema vascolare, nervi e cellule mesenchimali12,11,14.