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May 15, 2023

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Nature Communications volume

Nature Communications volume 14, numero articolo: 2734 (2023) Citare questo articolo

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I tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) costituiscono una vasta e preziosa banca di materiale per i pazienti per l'anamnesi clinica e i dati di follow-up. È ancora difficile ottenere un profilo di RNA a singola cellula/nucleo (sc/snRNA) nei tessuti FFPE. Qui, sviluppiamo una tecnologia di sequenziamento di snRNA basata su goccioline (snRandom-seq) per tessuti FFPE catturando RNA totali a lunghezza intera con primer casuali. snRandom-seq mostra un tasso di doppietto minore (0,3%), una copertura di RNA molto più elevata e rileva più RNA non codificanti e RNA nascenti, rispetto alle tecnologie scRNA-seq all'avanguardia ad alto rendimento. snRandom-seq rileva una mediana di> 3000 geni per nucleo e identifica 25 tipi cellulari tipici. Inoltre, applichiamo snRandom-seq su un campione clinico di cancro al fegato umano in FFPE e riveliamo un'interessante sottopopolazione di nuclei con elevata attività proliferativa. Il nostro metodo fornisce una potente piattaforma snRNA-seq per campioni clinici FFPE e promette enormi applicazioni nella ricerca biomedica.

I tessuti di routine fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) sono i campioni archiviabili più comuni e costituiscono una vasta e preziosa banca di materiale per i pazienti per l'anamnesi clinica, i dati di follow-up, ecc.1. La morfologia dei tessuti e i dettagli cellulari dei tessuti FFPE sono ben conservati per l'istopatologia grazie alla reticolazione della formaldeide tra DNA, RNA e proteine. Inevitabilmente, le modifiche irreversibili causate dalla fissazione in formalina sulle macromolecole nei campioni FFPE rendono sempre difficile l'applicazione in biologia molecolare. Studi recenti hanno fatto grandi progressi nella profilazione della trascrizione nei campioni FFPE mediante metodi ottimali di estrazione dell'RNA2 o profilazione spaziale in situ3. Negli ultimi anni, i metodi di sequenziamento dell'RNA di singole cellule/nuclei ad alto rendimento (scRNA/snRNA-seq) hanno rivoluzionato l'intero campo della ricerca biomedica4,5,6. Abbiamo costruito il primo atlante di cellule umane e di topo con le nostre piattaforme scRNA-seq personalizzate ad alto rendimento7,8. Si ritiene che la caratterizzazione trascrittomica accurata di ogni singola cellula nei campioni clinici FFPE abbia la capacità di fornire una migliore comprensione dell'eterogeneità cellulare e delle dinamiche della popolazione, migliorando così la precisione diagnostica, il trattamento e la prognosi delle malattie umane. Tuttavia, sia l'isolamento di singole cellule/nuclei intatti che la cattura dell'RNA dai tessuti FFPE sono ancora impegnativi a causa della reticolazione, della modifica e della degradazione dell'RNA.

Attualmente, le più popolari piattaforme sc/snRNA-seq ad alto rendimento, come la soluzione 10X Genomics Chromium Single Cell 3', si basano su oligo(dT) per catturare poli(A)+ RNA, in modo tale che principalmente l'RNA messaggero (mRNA) maturato essere rilevati anziché RNA non poliadenilati per l'analisi. Inoltre, questi metodi sc/snRNA-seq basati su oligo(dT) sono principalmente limitati a campioni freschi o appena congelati, poiché i primer oligo(dT) di solito falliscono sugli RNA degradati. Sono stati sviluppati vari metodi per superare queste sfide da diverse prospettive. SMART-seq-total9 e VASA-seq10 catturano sia le trascrizioni poliadenilate che quelle non poliadenilate implementando un passaggio aggiuntivo di coda di tutte le molecole di RNA con poli(A). D'altra parte, è stato segnalato che SPLiT-seq11 è stato utilizzato con successo in cellule fissate utilizzando un primer casuale che era più efficiente e più ampio per catturare gli RNA totali12,13. Tuttavia, questi metodi non erano ancora utilizzabili per i tessuti FFPE. Due metodi recentemente pubblicati su bioRxiv, snPATHO-Seq14 e snFFPE-seq15, hanno fornito metodi ottimizzati per isolare singoli nuclei intatti dai tessuti FFPE per eseguire snRNA-Seq, il che dimostra la fattibilità di snRNA-Seq nei tessuti FFPE e sblocca una dimensione di questi campioni difficili da usare. snPATHO-Seq dipende dalla tecnologia 10X Genomics basata su sonde in modo che possano essere rilevati solo geni limitati14. snFFPE-seq utilizza la piattaforma genomica 10X basata su poli(A), che non è sufficientemente sensibile per catturare gli RNA di bassa qualità dai tessuti FFPE15. In pratica, è sempre necessaria una profilazione trascrittomica completa e su larga scala dei campioni clinici per identificare biomarcatori predittivi o tipi cellulari rari. Pertanto, l'obiettivo generale è quello di avere un approccio in grado di soddisfare l'esigenza di snRNA-seq ad alta produttività, alta sensibilità e alta copertura sui tessuti FFPE.