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Oct 14, 2023

Nuovo metodo stereologico per la stima del conteggio delle cellule negli scaffold di collagene 3D

Scientific Reports volume 13,

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 7959 (2023) Citare questo articolo

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Gli attuali metodi per valutare la proliferazione cellulare negli scaffold 3D si basano sui cambiamenti nell'attività metabolica o nel DNA totale, tuttavia, la quantificazione diretta del numero di cellule negli scaffold 3D rimane una sfida. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un approccio stereologico imparziale che utilizza il campionamento casuale sistematico e il sezionamento ottico sul piano focale sottile degli scaffold seguito dalla stima del numero totale di cellule (StereoCount). Questo approccio è stato convalidato rispetto a un metodo indiretto per misurare il DNA totale (contenuto di DNA); e la camera di conteggio Bürker, l'attuale metodo di riferimento per quantificare il numero di cellule. Abbiamo valutato il numero totale di cellule per la densità di semina cellulare (cellule per unità di volume) su quattro valori e abbiamo confrontato i metodi in termini di precisione, facilità d'uso e richieste di tempo. L'accuratezza di StereoCount ha nettamente superato il contenuto di DNA per i casi con ~ 10.000 e ~ 125.000 cellule/impalcatura. Per i casi con ~ 250.000 e ~ 375.000 cellule/impalcatura, sia il contenuto StereoCount che quello del DNA hanno mostrato una precisione inferiore rispetto al Bürker ma non differivano l'uno dall'altro. In termini di facilità d'uso, StereoCount ha presentato un forte vantaggio dovuto all'output in termini di numeri di cellule assoluti insieme alla possibilità di una panoramica della distribuzione delle cellule e all'uso futuro dell'automazione per l'analisi ad alto rendimento. Nel complesso, il metodo StereoCount è un approccio efficiente per la quantificazione diretta delle cellule negli scaffold di collagene 3D. Il suo principale vantaggio è che StereoCount automatizzato potrebbe accelerare la ricerca utilizzando scaffold 3D incentrati sulla scoperta di farmaci per un’ampia varietà di malattie umane.

La quantificazione del numero di cellule in un volume definito è una metrica essenziale per le comunità mondiali di bioscienziati e ricercatori preclinici. Nelle discipline che comportano la dispersione delle cellule in volumi 3D, ad esempio gli scaffold di collagene 3D, sono necessarie stime affidabili delle cellule per l'avvio degli esperimenti, ad esempio la semina delle cellule e la valutazione della morte e della proliferazione cellulare nel tempo. L'enumerazione dei numeri cellulari in questi casi è limitata a due approcci principali: la camera di Bürker per la conta cellulare diretta da sospensioni cellulari omogenee (fase liquida); e approcci basati sulla fluorescenza per la stima del DNA totale, ad esempio CyQuant®1,2. Gli svantaggi dell'approccio del DNA totale sono la lisi cellulare dalla pre-elaborazione del campione come la digestione dell'impalcatura mediante collagenasi e la necessità di una curva di calibrazione per ciascun esperimento per garantire la corretta lettura e le correlazioni tra la linearità dell'intensità del segnale e il numero di cellule. Pertanto, non esiste un metodo quantitativo diretto per la stima del conteggio delle cellule negli scaffold 3D.

Per affrontare questo problema, presentiamo StereoCount™, un nuovo metodo basato sulla stereologia per la quantificazione diretta della conta cellulare assoluta negli scaffold di collagene 3D (Fig. 1).

Impalcatura di collagene 3D seminata con cellule e utilizzata per la quantificazione della conta cellulare.

Dimostriamo l'approccio utilizzando la microscopia a fluorescenza seguita da un sezionamento ottico e un'analisi delle immagini, come dettagliato in Materiali e metodi e nella Figura 2. In secondo luogo, per evitare distorsioni introdotte dal conteggio manuale e migliorare la produttività, introduciamo un flusso di lavoro automatizzato utilizzando FIJI-ImageJ3 che utilizza due script macro e un passaggio intermedio basato sull'apprendimento automatico superficiale (NL). Tra i vantaggi vi sono il metodo che non richiede la digestione dello scaffold o il sezionamento al microtomo e, come approccio basato sul microscopio, fornisce una panoramica della distribuzione cellulare nello scaffold come informazione aggiuntiva. Qui confrontiamo e contrapponiamo StereoCount con il metodo del contenuto di DNA basato sul rilevamento della fluorescenza del DNA totale; e conteggi cellulari utilizzando il metodo della camera di conteggio (Bürker), un metodo generalmente affidabile per la quantificazione cellulare.

Procedura di campionamento StereoCount durante la microscopia. Gli scaffold di collagene tridimensionali (3D) vengono campionati in 9 campi visivi XY e 30 stack Z. Il conteggio delle cellule viene determinato per ciascuna colonna utilizzando la scansione ottica sul piano focale sottile (metodo del disettore ottico). Il conteggio delle cellule dalle colonne viene ricalcolato sull'intero volume dello scaffold di collagene.