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Mar 07, 2023

Sequenziamento parallelo di DNA circolari extracromosomici e trascrittomi in singole cellule tumorali

Nature Genetics volume 55,

Nature Genetics volume 55, pagine 880–890 (2023) Citare questo articolo

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I DNA extracromosomici (ecDNA) sono comuni nel cancro, ma molte domande sulla loro origine, sulle dinamiche strutturali e sull’impatto sull’eterogeneità intratumorale sono ancora irrisolte. Qui descriviamo il sequenziamento del DNA circolare extracromosomico a cellula singola e del trascrittoma (scEC&T-seq), un metodo per il sequenziamento parallelo di DNA circolari e mRNA a lunghezza intera da singole cellule. Applicando scEC&T-seq alle cellule tumorali, descriviamo le differenze intercellulari nel contenuto di ecDNA studiandone l'eterogeneità strutturale e l'impatto trascrizionale. Gli ecDNA contenenti oncogeni erano presenti clonalmente nelle cellule tumorali e determinavano differenze nell'espressione degli oncogeni intercellulari. Al contrario, altri piccoli DNA circolari erano esclusivi delle singole cellule, indicando differenze nella loro selezione e propagazione. Le differenze intercellulari nella struttura dell'ecDNA indicavano la ricombinazione circolare come meccanismo di evoluzione dell'ecDNA. Questi risultati dimostrano che scEC&T-seq è un approccio per caratterizzare sistematicamente il DNA circolare piccolo e grande nelle cellule tumorali, il che faciliterà l’analisi di questi elementi del DNA nel cancro e oltre.

Misurare più parametri nelle stesse cellule è fondamentale per comprendere con precisione i sistemi biologici e i loro cambiamenti durante le malattie1. Nel caso dei DNA circolari, è fondamentale integrare le informazioni sulla sequenza del DNA con le misurazioni dell'output trascrizionale per valutare il loro impatto funzionale sulle cellule. Nelle cellule umane si possono distinguere almeno tre tipi di DNA circolari2,3,4,5: (1) piccoli DNA circolari (<100 kb)6, che sono stati descritti con nomi diversi tra cui eccDNA6, microDNA4, DNA circolari apoptotici6, piccoli DNA circolari polidispersi7 e DNA circolari telomerici o C-cerchi8; (2) Cerchi di escissione del recettore delle cellule T (TREC)9; e (3) DNA extracromosomici circolari grandi (>100 kb), oncogenici, con numero di copie amplificato10,11 (denominati ecDNA e visibili come cromosomi doppi minuti durante la metafase12). Nonostante la nostra crescente capacità di caratterizzare molteplici caratteristiche nelle singole cellule13, una caratterizzazione approfondita del contenuto, della struttura e della sequenza del DNA circolare nelle singole cellule rimane sfuggente con gli approcci attuali.

Nel cancro, le amplificazioni degli oncogeni sull'ecDNA sono di particolare interesse perché guidano potentemente l'eterogeneità del numero di copie intercellulari attraverso la loro capacità unica di essere replicati e segregati in modo ineguale durante la mitosi14,15,16,17,18,19. Questa eterogeneità consente ai tumori di adattarsi ed eludere le terapie2,20,21,22. In effetti, i pazienti con tumori che ospitano ecDNA hanno esiti clinici avversi11. Recenti indagini indicano che gli ecDNA contenenti potenziatori interagiscono tra loro negli hub nucleari17,23 e possono influenzare posizioni cromosomiche distanti in trans23,24. Ciò suggerisce che anche gli ecDNA che non ospitano oncogeni possono essere funzionali23,24. Inoltre, abbiamo recentemente rivelato che i tumori ospitano un repertorio imprevisto di DNA circolari più piccoli, privi di numero di copie, di rilevanza funzionale ancora sconosciuta3.

In questo studio, riportiamo il sequenziamento del DNA circolare extracromosomico a cellula singola e del trascrittoma (scEC&T-seq), un metodo che consente il sequenziamento parallelo di tutti i tipi di DNA circolare, indipendentemente dalla loro dimensione, contenuto e numero di copie, e mRNA a lunghezza intera in singolo cellule. Dimostriamo la sua utilità per la profilazione di singole cellule tumorali contenenti sia ecDNA multiframmentati strutturalmente complessi che piccoli DNA circolari.

Gli attuali approcci all'avanguardia alla purificazione del DNA circolare prevedono tre passaggi sequenziali, ovvero l'isolamento del DNA seguito dalla rimozione del DNA lineare attraverso la digestione con esonucleasi e l'arricchimento del DNA circolare mediante amplificazione a cerchio rotante3,6,25. Abbiamo ritenuto che questo approccio possa essere ridotto a singole cellule e, se combinato con Smart-seq2 (rif. 26), possa consentire il sequenziamento parallelo di DNA circolare e mRNA. Per valutare il nostro metodo in singole cellule, abbiamo utilizzato linee cellulari di cancro al neuroblastoma, che avevamo precedentemente caratterizzato in popolazioni di massa3. Abbiamo utilizzato FACS per separare le cellule in piastre da 96 pozzetti (Fig. 1a, Figura 1a, b supplementare e Tabella 1 supplementare). Il DNA è stato separato dall'RNA poliadenilato, che è stato catturato su sfere magnetiche accoppiate a sequenze a filamento singolo di primer di deossitimidina (Oligo dT), analogamente agli approcci precedenti27. Il DNA è stato sottoposto a digestione con esonucleasi, come eseguito con successo in passato in popolazioni di cellule sfuse, per arricchirsi di DNA circolare3,6,25 (Fig. 1b). Il DNA sottoposto all'endonucleasi PmeI prima della digestione con esonucleasi fungeva da controllo negativo3. In un sottogruppo di casi, il DNA è stato lasciato non digerito come controllo aggiuntivo (Fig. 1b). Il DNA rimanente dopo i diversi regimi di digestione è stato amplificato. Il DNA amplificato è stato sottoposto al sequenziamento accoppiato Illumina e in alcuni casi al sequenziamento di Nanopore a lettura lunga (Fig. 1a). È stata analizzata la composizione della sequenza del DNA circolare e l'origine genomica è stata dedotta nelle regioni circolarizzate utilizzando algoritmi computazionali precedentemente stabiliti per l'analisi del DNA circolare3.