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Oct 20, 2023

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Communications Biology volume

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 201 (2023) Citare questo articolo

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Identificare gli individui dalle miscele biologiche a cui hanno contribuito è molto importante nelle indagini sulla scena del crimine e in vari campi di ricerca biomedica, ma nonostante i tentativi precedenti, rimane quasi impossibile. Qui abbiamo studiato il potenziale dell'utilizzo del sequenziamento del trascrittoma di singola cellula (scRNA-seq), abbinato a una pipeline bioinformatica dedicata (De-goulash), per risolvere questo problema di lunga data. Abbiamo sviluppato un nuovo approccio e lo abbiamo testato con dati scRNA-seq che abbiamo generato de-novo da miscele di sangue di più persone e anche miscele in-silico che abbiamo assemblato da set di dati scRNA-seq pubblici di singoli individui, coinvolgendo diversi numeri, rapporti e ascendenze biogeografiche dei contributori. Per tutte le miscele di sangue bilanciate e sbilanciate da 2 a 9 persone con rapporti fino a 1:60, abbiamo ottenuto una chiara separazione unicellulare in base agli individui che hanno contribuito. Per tutti i contributori della miscela separata, il sesso e l'ascendenza biogeografica (materna, paterna e biparentale) sono stati determinati correttamente. Tutti i contributori separati sono stati identificati correttamente individualmente con certezza statistica accettabile dal tribunale utilizzando i dati di riferimento del sequenziamento dell'intero esoma generati de-novo. In questo studio di prova di concetto, dimostriamo la fattibilità di approcci unicellulari per deconvolure miscele biologiche e successivamente caratterizzare geneticamente e identificare individualmente i contributori della miscela separata. Con un’ulteriore ottimizzazione e implementazione, questo approccio potrebbe eventualmente consentire di passare a miscele biologiche impegnative, comprese quelle trovate sulle scene del crimine.

La caratterizzazione genetica e l'identificazione genetica individuale delle persone che hanno contribuito alle miscele biologiche sono rilevanti in diversi ambiti della scienza e della società. Miscele biologiche con il contributo di più di un individuo vengono spesso raccolte sulle scene del crimine. Nei casi con autori noti, l'identificazione genetica individuale può individuare un autore tramite la profilazione comparativa del DNA forense1, mentre in quelli con autori sconosciuti, la caratterizzazione genetica (ad esempio sul sesso, sull'ascendenza biogeografica) può fornire indizi investigativi per aiutare a trovare l'autore sconosciuto1. Il successo della caratterizzazione genetica e dell'identificazione degli individui provenienti da biomateriali misti inizia con un'accurata deconvoluzione della miscela, cioè la separazione del biomateriale misto in base ai singoli contributori, che è il passo più cruciale, ma allo stesso tempo più difficile. Nonostante i vari tentativi basati su metodologie diverse, i limiti nella deconvoluzione delle miscele biologiche rimangono una delle maggiori sfide dell’analisi forense del DNA2,3,4,5,6. Inoltre, la separazione delle miscele è rilevante anche in altre aree della ricerca e delle applicazioni biomediche, ad esempio per rilevare e risolvere la contaminazione in colture cellulari, tissutali e organoidi ampiamente utilizzate.

Attualmente, la tecnica più comune utilizzata nella deconvoluzione delle miscele forensi è la lisi differenziale7, che viene applicata a miscele che coinvolgono cellule spermatiche dell'autore del reato di sesso maschile e cellule epiteliali della vittima femminile tipicamente riscontrate nei casi di violenza sessuale analizzando i tamponi vaginali. Tuttavia, la lisi differenziale spesso comporta una separazione incompleta delle frazioni del DNA maschile e femminile. Di conseguenza, il profilo autosomico risultante di ripetizione tandem breve (STR) mostra ancora una miscela di alleli della vittima femminile e dell'autore del reato maschio. Ciò rende difficile, e spesso impossibile, isolare il profilo STR dell'autore del reato di sesso maschile dal profilo misto del DNA, anche se il profilo STR della vittima femminile è noto dall'analisi del DNA di riferimento8. Mirare alla porzione specifica del maschio del cromosoma Y offre un aiuto in quanto consente di analizzare in modo specifico gli STR specifici del maschio nella miscela e funziona in miscele con ampio accesso di DNA femminile come nel materiale proveniente da casi di violenza sessuale9. Tuttavia, la profilazione Y-STR forense presenta lo svantaggio che molto spesso non è in grado di distinguere tra uomini imparentati per via paterna che in genere condividono lo stesso profilo Y-STR. Di conseguenza, la probabilità di corrispondenza ottenuta per il sospettato maschio valeva anche per i suoi parenti maschi paterni e quindi non è possibile trarre conclusioni a livello individuale come richiesto in tribunale9. Sono disponibili10,11,12,13 metodi per deconvolure profili STR autosomici misti ottenuti da colorazioni miste con l'aiuto di metodi statistici, come la genotipizzazione probabilistica, ma il loro successo è limitato e dipende da molti fattori12,13. A causa della sua natura quantitativa, l'uso del sequenziamento di nuova generazione (NGS), denominato anche sequenziamento massivo parallelo (MPS), per la profilazione STR forense fornisce alcuni miglioramenti nella deconvoluzione dei profili STR misti, ma il suo successo è principalmente limitato a quelli meno complessi miscele come quelle di due persone1. Inoltre, la lisi differenziale non è adatta per risolvere miscele di sperma di uomini diversi e nemmeno per miscele che non contengono spermatozoi.