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Le cellule T γδ sono effettori dell'immunoterapia nei tumori con difetti HLA di classe I

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Oct 21, 2023

Le cellule T γδ sono effettori dell'immunoterapia nei tumori con difetti HLA di classe I

Nature volume 613, pages

Natura volume 613, pagine 743–750 (2023) Citare questo articolo

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I tumori con deficit di riparazione del disadattamento del DNA (MMR-d) presentano un'abbondanza di neoantigeni che si ritiene spieghi la loro eccezionale reattività al blocco del checkpoint immunitario (ICB)1,2. Qui, a differenza di altri tipi di cancro3,4,5, abbiamo osservato che 20 su 21 (95%) tumori MMR-d con inattivazione genomica della β2-microglobulina (codificata da B2M) mantenevano la risposta all'ICB, suggerendo il coinvolgimento di sistemi immunitari cellule effettrici diverse dalle cellule T CD8+ in questo contesto. Successivamente abbiamo identificato una forte associazione tra l'inattivazione di B2M e l'aumento dell'infiltrazione da parte delle cellule T γδ nei tumori MMR-d. Queste cellule T γδ comprendevano principalmente i sottoinsiemi Vδ1 e Vδ3 ed esprimevano alti livelli di PD-1, altri marcatori di attivazione, comprese molecole citotossiche e un ampio repertorio di recettori simili alle immunoglobuline delle cellule killer. In vitro, le cellule T PD-1+ γδ isolate da tumori del colon MMR-d hanno mostrato una maggiore reattività verso le linee cellulari di cancro al colon MMR-d negative per l'antigene leucocitario umano (HLA) di classe I e verso il tumore derivato dal paziente knockout B2M organoidi rispetto a cellule competenti nella presentazione dell'antigene. Confrontando campioni tumorali accoppiati di pazienti con cancro del colon MMR-d ottenuti prima e dopo il doppio blocco PD-1 e CTLA-4, abbiamo scoperto che il blocco del checkpoint immunitario aumentava sostanzialmente la frequenza delle cellule T γδ nei tumori carenti di B2M. Presi insieme, questi dati indicano che le cellule T γδ contribuiscono alla risposta al blocco del checkpoint immunitario nei pazienti con tumori del colon MMR-d HLA di classe I negativi e sottolineano il potenziale delle cellule T γδ nell'immunoterapia antitumorale.

L'ICB mirato agli assi PD-1–PD-L1 e/o CTLA-4 offre benefici clinici duraturi ai pazienti affetti da tumori con MMR-d ed elevata instabilità dei microsatelliti6,7,8,9. Si ritiene che le eccezionali risposte dei tumori con MMR-d ed elevata instabilità dei microsatelliti all'ICB siano spiegate dal loro sostanziale carico di presunti neoantigeni, che hanno origine dall'ampio accumulo di mutazioni nei loro genomi1,2. Ciò è coerente con la visione attuale secondo cui il blocco di PD-1 aumenta principalmente l'immunità antitumorale endogena guidata dalle cellule T CD8+, che riconoscono i neoepitopi legati all'HLA di classe I sulle cellule tumorali10,11,12. Tuttavia, i tumori del colon MMR-d spesso perdono la presentazione dell'antigene mediata da HLA di classe I a causa del silenziamento dei geni HLA di classe I, di mutazioni inattivanti nella β2-microglobulina (codificata da B2M) o di altri difetti nel meccanismo di elaborazione dell'antigene13,14,15 ,16, che può rendere questi tumori resistenti all'immunità mediata dalle cellule T CD8+3,4,5,17. In particolare, le prime prove hanno indicato che i tumori MMR-d con deficit di B2M possono ottenere risposte durature al blocco del PD-118, suggerendo che sottoinsiemi di cellule immunitarie diversi dalle cellule T CD8+ contribuiscono a queste risposte.

I sottoinsiemi di cellule immunitarie HLA di classe I senza restrizioni, che hanno la capacità di uccidere le cellule tumorali, includono cellule natural killer (NK) e cellule T γδ. Le cellule T γδ condividono molte caratteristiche con la loro controparte delle cellule T αβ, come le funzioni effettrici citotossiche, ma esprimono un TCR distinto composto da una catena γ e una δ. Diversi sottoinsiemi di cellule T γδ sono definiti dal loro utilizzo della catena δ del TCR, di cui quelli che esprimono Vδ1 e Vδ3 sono principalmente "residenti nel tessuto" nei siti della mucosa, mentre quelli che esprimono Vδ2 si trovano principalmente nel sangue19. Sia i meccanismi di attivazione adattativi che quelli innati, ad esempio attraverso la stimolazione del loro TCR γδ o dei recettori innati come NKG2D, DNAM-1, NKp30 o NKp44, sono stati descritti per le cellule T γδ20. I recettori immunoglobuline-simili (KIR) delle cellule killer sono espressi dalle cellule T γδ e regolano la loro attività in base all'espressione HLA di classe I nelle cellule bersaglio21. Inoltre, è stato scoperto che le cellule T γδ esprimono alti livelli di PD-1 nei tumori del colon-retto MMR-d (CRC)22, suggerendo che queste cellule potrebbero essere prese di mira dal blocco del PD-1.

4, which represents a predefined threshold25. Consistent with the study protocol of the DRUP23, the primary outcome measure for our analysis was clinical benefit, defined as disease control of ≥16 weeks, and the secondary outcome measure was best overall response, all assessed according to the RECIST 1.1 guidelines by the local treatment team at the site of accrual. As determined in the study protocol, these outcome measures were considered to be evaluable in patients who received at least two cycles of intravenous study medication, and for whom the response was radiologically or clinically evaluable (at the treating physician's discretion). For genomics and transcriptomics analyses, fresh frozen tumour biopsies were obtained at the baseline (that is, before PD-1 blockade). WGS analysis (median depths, ~100× and ~40× for tumour and normal, respectively) and bioinformatics analyses were performed as previously described23,25, with an optimized pipeline based on open-source tools that is freely available at GitHub (https://github.com/hartwigmedical/pipeline5). The TMB per Mb was determined by counting the genome-wide number of mutations (SNVs, MNVs and indels) and dividing this number by the number of megabases sequenced. For RNA-seq analysis, we extracted total RNA using the QIAGEN QIAsymphony RNA kit (931636). Samples with approximately 100 ng total RNA were prepared using KAPA RNA Hyper + RiboErase HMR (8098131702) and the RNA libraries were paired-end sequenced on the Illumina NextSeq550 platform (2 × 75 bp) or the Illumina NovaSeq6000 platform (2 × 150 bp). Raw RNA reads (FASTA files) were aligned to the human reference genome (GRCh38) using STAR46, (v.2.7.7a) using the default settings in two-pass mode./p>0.5 (the situation in which a mutation is more likely subclonal than clonal), as determined using PURPLE (v.2.34)47./p>3,000) were filtered out from the analysis, resulting in a final dataset of 4,442 cells, derived from HTO1 (n = 332), HTO6 (n = 105), HTO7 (n = 1,100), HTO8 (n = 1,842) and HTO9 (n = 1,063). Data were normalized using the LogNormalize function of Seurat with a scale factor of 10,000. Variable features were identified using the FindVariableFeatures function of Seurat returning 2,000 features. We next applied the RunFastMNN function of SeuratWrappers split by sample ID to adjust for potential batch-derived effects across the samples57. Uniform manifold approximation and projection (UMAP)58 was used to visualize the cells in a two-dimensional space, followed by the FindNeighbors and FindClusters functions of Seurat. Data were scaled, and heterogeneity associated with mitochondrial contamination was regressed out. Cell clusters were identified by performing differentially expressed gene analysis using the FindAllMarkers function, with min.pct and logfc.threshold at 0.25. The number of TRDV1+ (Vδ1, n = 1,927), TRDV2+ (Vδ2, n = 860) or TRDV3+ (Vδ3, n = 506) cells was determined as the percentage of all cells with an expression level of >1, with <1 for the other TCR Vδ chains. CRC96, 134 and 167 had less than ten TRDV3+ cells, and were not included in the Vδ3 analysis. Transcripts of Vδ4 (TRDV4), Vδ5 (TRDV5) and Vδ8 (TRDV8) cells were not detected. The percentage of cells positive for a certain gene was determined as all cells with an expression level of >1./p>170,000-fold increase in 3–4 weeks of expansion of γδ T cells (Extended Data Fig. 4c)./p>hB2M[NM_004048.4](ns):T2A:Puro), produced in lentivirus according to standard methodology. Cells were selected using puromycin and then FACS-sorted on the basis of HLA-A/B/C expression using 1:100 anti-HLA-A/B/C-FITC (W6/32, eBioscience)./p>