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Gli eosinofili attivi regolano la difesa dell’ospite e le risposte immunitarie nella colite

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Gli eosinofili attivi regolano la difesa dell’ospite e le risposte immunitarie nella colite

Nature volume 615, pages

Natura volume 615, pagine 151–157 (2023) Citare questo articolo

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Negli ultimi dieci anni, la trascrittomica unicellulare ha contribuito a scoprire nuovi tipi e stati cellulari e ha portato alla costruzione di un compendio cellulare di salute e malattia. Nonostante questi progressi, alcune cellule difficili da sequenziare rimangono assenti dagli atlanti tissutali. Gli eosinofili – granulociti sfuggenti implicati in una vasta gamma di patologie umane1,2,3,4,5 – sono tra questi tipi di cellule inesplorate. L’eterogeneità degli eosinofili e i programmi genetici che sostengono le loro funzioni pleiotropiche rimangono poco compresi. Qui forniamo un profilo trascrittomico completo di una singola cellula degli eosinofili del topo. Identifichiamo una popolazione attiva e una basale di eosinofili intestinali, che differiscono nel loro trascrittoma, proteoma superficiale e localizzazione spaziale. Mediante uno schermo di inibizione CRISPR sull'intero genoma e test funzionali, riveliamo un meccanismo mediante il quale l'interleuchina-33 (IL-33) e l'interferone-γ (IFNγ) inducono l'accumulo di eosinofili attivi nel colon infiammato. Gli eosinofili attivi sono dotati di attività battericida e regolatoria delle cellule T ed esprimono le molecole costimolatorie CD80 e PD-L1. In particolare, gli eosinofili attivi sono arricchiti nella lamina propria di una piccola coorte di pazienti con malattia infiammatoria intestinale e sono strettamente associati alle cellule T CD4+. I nostri risultati forniscono approfondimenti sulla biologia degli eosinofili ed evidenziano il contributo cruciale di questo tipo di cellule all’omeostasi intestinale, alla regolazione immunitaria e alla difesa dell’ospite. Inoltre, poniamo un quadro per la caratterizzazione degli eosinofili nelle malattie gastrointestinali umane.

Gli eosinofili sono granulociti che risiedono principalmente nel timo, nell'utero, nei polmoni, nel tessuto adiposo e nel tratto gastrointestinale (GI)1. Il loro accumulo è tipico di stati patologici quali infiammazione allergica delle vie aeree, dermatite atopica, esofagite eosinofila e malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD)2,3,4,5. Gli eosinofili GI contribuiscono a vari processi omeostatici, tra cui la conservazione della barriera epiteliale, il supporto dell'architettura dei tessuti, il mantenimento delle popolazioni di cellule immunitarie e la regolazione delle risposte immunitarie locali6,7,8,9. Tuttavia, la loro funzione durante l’infiammazione intestinale non è chiara10. Inoltre, la presenza di sottoinsiemi di eosinofili funzionalmente distinti e la loro relazione ontogenetica sono rimasti in gran parte non studiati a causa di sfide tecniche che ne impediscono l'interrogazione trascrittomica. In effetti, gli eosinofili sono praticamente assenti negli atlanti di sequenziamento dell'RNA di singole cellule umane e murine (scRNA-seq)11,12 e quindi rappresentano un punto cieco nella nostra comprensione dei contributi specifici del tipo cellulare alla malattia. Qui, colmiamo questa lacuna nella conoscenza risolvendo l’eterogeneità trascrizionale e funzionale degli eosinofili lungo la loro traiettoria di sviluppo dal midollo osseo (BM) ai tessuti di residenza e definendo il loro ruolo durante l’infiammazione intestinale.

Riducendo al minimo lo shear stress, la degranulazione e la conseguente degradazione del trascritto (Extended Data Fig. 1a), abbiamo ottenuto trascrittomi unicellulari da eosinofili isolati dal midollo osseo, sangue, milza, stomaco, intestino tenue e colon di topi Il5-tg, un ceppo che ha un numero elevato di eosinofili nei tessuti13 (Dati estesi Fig. 1b,c). Abbiamo scoperto che l'89% di tutte le cellule esprimeva ampiamente i marcatori eosinofili in buona fede Siglecf, Il5ra, Ccr3 ed Epx (Dati estesi Fig. 1d). Il clustering ha rivelato cinque sottopopolazioni ordinate lungo una traiettoria di sviluppo (Fig. 1a,b). Precursori altamente ciclici ed eosinofili immaturi erano presenti principalmente nel midollo osseo, mentre gli eosinofili circolanti erano principalmente nel sangue. Due sottoinsiemi, denominati eosinofili attivi (A-Eos) ed eosinofili basali (B-Eos), popolavano i tessuti gastrointestinali in proporzioni variabili (Fig. 1c e Dati estesi Fig. 1e).

a, Approssimazione e proiezione molteplice uniforme (UMAP) dei trascrittomi degli eosinofili ottenuti dal midollo osseo, sangue, milza, intestino tenue, stomaco e colon di topi Il5-tg (n = 3). b, Traiettoria di differenziazione degli eosinofili. c, Distribuzione di sottoinsiemi tra gli organi (% di eosinofili). d, Espressione di geni marcatori di cluster. Un elenco completo dei marcatori di cluster è disponibile nella Tabella supplementare 1. e, Top, UMAP dell'espressione Cd80 e Cd274. In basso, livelli di espressione su pseudotempo. f, in alto, UMAP dei profili proteomici degli eosinofili (citometria a flusso spettrale) isolati da sangue, milza, stomaco, colon e intestino tenue. In basso, mappa termica dell'espressione mediana dei marcatori di superficie tra i sottoinsiemi (n = 5, B6J). g, grafici FACS rappresentativi degli eosinofili A-Eos (PD-L1+CD80+) e PD-L1−CD80− negli organi. I numeri indicano la percentuale di eosinofili. h, Immunofluorescenza rappresentativa di Siglec-F e CD80 nel colon del topo (n = 3, B6J). Le frecce indicano Siglec-F+CD80+ A-Eos (rosso) e Siglec-F+CD80− B-Eos (verde). Nuclei colorati con DAPI. Barra della scala, 20 µm. i, Intensità media di fluorescenza (MFI) di CD63, SSC-A e Siglec-F nel colon A-Eos e B-Eos (n = 6, B6J). Sono mostrate le mediane. Test t di Student spaiato a due code. j, A sinistra, immagini rappresentative di A-Eos e B-Eos intestinali citospinati colorati con anti-EPX e DAPI (n = 3, Il5-tg). Barra della scala, 10 µm. A destra, quantificazione dell'intensità della colorazione EPX alla periferia e al centro della cellula. I dati sono media ± sd Test t di Student non appaiato a due code. k, rapporto attivo-basale nel terzo luminale rispetto a quello basale delle cripte del colon (n = 3, B6J). Test t di Student per coppie a due code. l, Sinistra, rapporto attivo-basale nel terzo luminale rispetto a quello basale delle cripte del colon di nuclei del colon umano sano (n = 5). Test t di Student per coppie a due code. A destra, rapporto attivo-basale in campioni di individui sani (5 individui, 9 nuclei), pazienti con malattia di Crohn (CD; 5 individui, 9 nuclei) e pazienti con colite ulcerosa (UC; 4 individui, 8 nuclei). ANOVA unidirezionale. I dati sono medi ± sd Le informazioni sul paziente sono fornite nella Tabella supplementare 2. In a, b, e, f, i punti rappresentano singole celle, colorate in base all'identità del cluster.

|2|) in BM-Eos treated with IL-33 and/or IFNγ (n = 4, B6J). All DEGs are listed in Supplementary Table 4. Bottom, expression of subset markers across conditions. Columns are clustered, rows are scaled. CPM, counts per million. b, Proliferation of anti-CD3/CD28-activated, CFSE-labelled naive CD4+ T cells co-cultured with BM-Eos conditioned with IL-33 and/or IFNγ (n = 4, B6J). Data are pooled from two independent experiments. Medians are shown. One-way ANOVA. c, A-Eos frequencies in mice treated with IL-33 and/or IFNγ (n = 5, B6J). Medians are shown. One-way ANOVA. d, A-Eos and B-Eos frequencies in DSS-treated B6J (n = 5) and Il33−/− (n = 4) mice. Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. e, Frequencies of IFNγ-, IL-17- and TNF-expressing colonic CD4+ T cells from mice in d. Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. f, Left, representative haematoxylin and eosin (H&E)-stained colonic sections of mice in d. Scale bar, 100 µm. Right, colitis score assessed by histopathological examination. Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. g, Representative molecular cartography images of human ulcerative colitis samples. Nuclei are stained with DAPI; CD4, SIGLEC8 and CD80 RNA molecules are shown in blue, red and yellow, respectively. Scale bar, 200 µm. h, Pairwise proximity score of transcripts across slides. The score indicates the fraction of slides in which the proximity of a pair of transcripts is significantly higher than expected by chance. P values are computed using a permutation test (Methods). Treg cells, regulatory T cells. i, Mean counts per slide of CD80 and NFKB1 transcripts in the proximity (<10 µm) of SIGLEC8 transcripts spatially associated with CD4 molecules versus SIGLEC8 molecules not associated with CD4 molecules. The central line in the box plot represents the median count per slide, the lower and upper hinge correspond to the first quartiles and the whisker extends from the hinge to the smallest or largest value no further than 1.5 times the interquartile range (IQR) from the hinge. Two-sided paired Wilcoxon test (17 regions of interest (ROIs), n = 4 patients)./p> 6). To quantify the co-expression of PD-L1 and MBP, the distance of each spot in the green channel to the nearest spot in the red channel was computed. Green spots (eosinophils) with distance to red spots < 4 µm were considered as active eosinophils (co-expressing PD-L1). Green spots with distance to red spots > 4 µm were considered basal eosinophils. The active-to-basal ratio was then computed by dividing the number of active by the number of basal eosinophils in each core. For localization analysis, the active-to-basal ratio in colon crypts of human and mouse tissue was calculated in manually drawn ROIs comprising the lower (basal) or upper (luminal) thirds./p> 0.5, P adjusted < 0.05) between A-Eos and tissue eosinophils. Non-parametric Wilcoxon rank sum test (FindMarkers function in Seurat). f, Representative FACS plots of PD-L1+CD80+and PD-L1−CD80− eosinophils in HDM- or PBS-treated mice (n = 2, B6J). Numbers indicate % of eosinophils. g, Left: Gating strategy used to identify resident (rEos) and inflammatory (iEos) eosinophils as described by17. Right: quantification of PD-L1+CD80+ and PD-L1−CD80− eosinophils in rEos and iEos. Medians are shown. h, MBP and PD-L1 immunofluorescence staining of human tissue microarrays. Representative cores from a healthy individual and a patient with Crohn's disease are shown (n = 5). Scale bars, 500 µm (core overview) and 10 µm (high magnification insets)./p> 0.5, adjusted P < 0.05) of circulating eosinophils found in the colon vs in the blood of C. rodentium-infected mice. Non-parametric Wilcoxon rank sum test (FindMarkers function in Seurat). g, Single-cell fate probabilities as calculated by CellRank and summarized for each cluster as a pie chart. Arrows represent velocity flow. Cells and pie charts coloured by cluster identity. h, Top: Workflow of in vitro conditioning. Bottom: A-Eos frequencies after conditioning with increasing doses of colon CM. Input: BM-derived (n = 5, B6J), blood (n = 5, Il5-tg) and splenic (n = 5, Il5-tg) eosinophils. Medians are shown. One-way ANOVA. i, Left: EYFP+ eosinophil frequencies over time across organs after single tamoxifen pulse in Id2CreERT2;RosaEYFP mice. Data represents mean ± SD. Right: Frequency of A-Eos and B-Eos in colonic EYFP+ eosinophils at day 2 and 4 post tamoxifen injection (n = 3, Id2CreERT2;RosaEYFP). Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. j, Antimicrobial and granulogenesis signature expression in A-Eos. k, Gene expression over common pseudotime at steady state (grey) and upon C. rodentium infection (dark red). Dots indicate single cells, coloured by organ: BM (blue), blood (yellow) and colon (red). l, Edu+/Edu− eosinophil ratio in the colon of C. rodentium-infected and control B6J (n = 5) and Il5-tg (n = 3) mice at day 4 post EdU injection. Data represent mean ± SEM. Two-tailed unpaired Student's t-test. m, Frequencies of eosinophil progenitors (gated as Live CD45+CD11b+IL5Ra+Lin-Sca1−CD34+) in C. rodentium-infected (n = 17) and control (n = 9) B6J mice. Medians are shown. Data pooled from two independent experiments. Two-tailed unpaired Student's t-test. n, MFI of CD63 in colonic A-Eos and B-Eos of C. rodentium-infected and control mice (n = 6, B6J). Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. o, EPX immunofluorescence of sorted A-Eos of C. rodentium-infected and control mice (n = 5, Il5-tg). Nuclei are stained with DAPI. Insets show protrusions. Scale bar, 10 µm./p>