Blog

Oct 26, 2023

Identificazione dei progenitori e SARS

Nature volume 588, pages

Natura volume 588, pagine 670–675 (2020)Citare questo articolo

Accessi 42k

175 citazioni

154 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

Il polmone distale contiene bronchioli terminali e alveoli che facilitano lo scambio di gas. I sistemi tridimensionali di coltura polmonare distale umana in vitro faciliterebbero fortemente lo studio di patologie come la malattia polmonare interstiziale, il cancro e la polmonite da coronavirus 2019 (COVID-19) causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Qui descriviamo lo sviluppo di un sistema di coltura a lungo termine privo di alimentatore e chimicamente definito per i progenitori polmonari distali come organoidi derivati ​​da singole cellule basali epiteliali alveolari umane di tipo II (AT2) o KRT5+. Gli organoidi AT2 sono stati in grado di differenziarsi in cellule AT1 e gli organoidi delle cellule basali hanno sviluppato lumi rivestiti con cellule mazze e ciliate differenziate. L'analisi di singole cellule delle cellule KRT5+ negli organoidi basali ha rivelato una popolazione distinta di cellule mitotiche ITGA6+ITGB4+, la cui progenie si è ulteriormente segregata in una sottofrazione TNFRSF12Ahi che comprendeva circa il dieci per cento delle cellule basali KRT5+. Questa sottopopolazione formava cluster all'interno dei bronchioli terminali e mostrava un'attività di crescita degli organoidi clonogenici arricchita. Abbiamo creato organoidi polmonari distali con polarità apicale verso l’esterno per presentare ACE2 sulla superficie esterna esposta, facilitando l’infezione di AT2 e colture basali con SARS-CoV-2 e identificando le cellule club come popolazione bersaglio. Questa coltura a lungo termine e senza alimentatore di organoidi polmonari distali umani, abbinata all’analisi di singole cellule, identifica l’eterogeneità funzionale tra le cellule basali e stabilisce un facile modello organoide in vitro delle infezioni polmonari distali umane, inclusa la polmonite associata a COVID-19.

Il polmone distale svolge funzioni respiratorie essenziali che possono essere compromesse da patologie infiammatorie, neoplastiche o infettive come la polmonite da COVID-19. Lo studio di queste condizioni sarebbe facilitato da robusti modelli in vitro basati su cellule umane. Le identità delle cellule staminali che rigenerano l'epitelio polmonare distale in vivo nel corso della vita umana sono state dedotte da studi sui topi, nonostante le differenze tra queste specie1. Negli esseri umani, le cellule staminali basali si estendono lungo l'intero albero delle vie aeree, mentre nel topo, le cellule club2 e/o le cellule non club3 che esprimono la secretoglobina 1A1 (SCGB1A1) rinnovano i bronchioli distali durante l'invecchiamento. Nella regione di scambio gassoso, le cellule epiteliali alveolari di tipo II (AT2) del topo generano cellule AT1 e AT2 durante l'omeostasi4,5 e vengono reclutati ulteriori progenitori in risposta a gravi lesioni3,6,7,8,9. La presenza e/o il ruolo dei progenitori facoltativi nel polmone umano sono sconosciuti. Le cellule AT2 umane possono essere differenziate in cellule AT1, ma queste colture hanno vita breve e non dimostrano autorinnovamento a lungo termine né consentono l'espansione per la modellizzazione della malattia4,10,11; inoltre, i loro requisiti per le celle feeder impediscono la definizione di componenti di nicchia specifici12,13. Abbiamo stabilito una coltura organoide a lungo termine del polmone umano distale, comprese le cellule staminali AT2 e basali, e abbiamo utilizzato questo sistema per convalidare le cellule progenitrici funzionali e modellare l’infezione da SARS-CoV-2.

Abbiamo definito empiricamente condizioni medie per supportare l'espansione clonale dei progenitori distali del polmone umano da 136 individui nella matrice extracellulare di collagene / laminina (ECM) (Fig. 1a, Tabella supplementare 1). Insieme, EGF e l'antagonista BMP NOGGIN hanno supportato la crescita di cellule polmonari distali disaggregate o di loro frazioni epiteliali purificate (Dati estesi Fig. 1a-c). Singole cellule (dati estesi Fig. 1d-g) espanse in organoidi cistici SFTPC + HTII-280 + AT2 (Fig. 1b-e) o organoidi solidi KRT5 + che esprimono il marcatore di cellule basali KRT5 (Fig. 1b, f-h).

UN. Le colture di organoidi del polmone distale umano D14 (giorno 14) contengono organoidi cistici e solidi. In basso a sinistra, campo chiaro; a destra, ematossilina ed eosina (H&E). Barra della scala, 100 μm. b, Immunofluorescenza a montaggio intero con anticorpi anti-KRT5 (cellule basali), anti-SFTPC (cellule AT2) e anti-SCGB1A1 (cellule club). Barra della scala, 100 μm. c – e, organoidi alveolari su D32. c, organoide cistico AT2. LUI; barra della scala, 25 μm. d, Immunofluorescenza a montaggio intero per anti-SFTPC, anti-HTII-280, falloidina (Ph) e DAPI; barra della scala, 50 μm. e, fluorescenza Anti-KI67 e DAPI di una sezione adiacente a d. f – h, organoidi basali su D32. f, H&E; barra della scala, 50 μm. g, immunofluorescenza a montaggio intero per anti-KRT5 e DAPI; barra della scala, 100 μm. h, immunocolorazione Anti-KI67 e DAPI della sezione adiacente a g. i-k, RNA-seq unicellulare degli organoidi polmonari distali totali in D28. i, grafico t-Distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) di 7.285 celle individuali che dimostrano popolazioni AT2, basali e club. j, Espressione di SFTPC (AT2), KRT5 (basale) e SCGB1A1 (club). k, grafici delle caratteristiche per l'espressione di SFTPC (AT2), KRT5 (basale) e SCGB1A1 (club). l–p, coltura organoide clonogenica AT2. l, microscopia in campo chiaro degli organoidi AT2 a D180; barra della scala, 200 μm. m, colorazione H&E dalla coltura come in l; barra della scala, 50 μm. n, microscopia elettronica a trasmissione dell'organoide AT2 in D32. LB, corpo lamellare; barra della scala, 5 μm. o, p, Immunofluorescenza dell'organoide AT2 in D32 (o); la coltura su vetro per altri 10 giorni induce la differenziazione in cellule AT1 (p). Immunofluorescenza per anti-HTI-56 (AT1) e anti-HTII-280 (AT2); barra della scala, 50 μm. q, scRNA-seq presentano grafici di 2.780 cellule organoidi AT2 su D89 della coltura cumulativa.