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Oct 19, 2023

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Communications Biology volume

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 173 (2023) Citare questo articolo

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Gli organoidi del cervello umano bioingegnerizzati e completamente maturati rappresentano modelli tridimensionali di mimetica cerebrale in vitro di grande valore per ricapitolare lo sviluppo del cervello in vivo, le malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative. Vari segnali istruttivi che influenzano molteplici processi biologici tra cui la morfogenesi, gli stadi di sviluppo, le transizioni del destino cellulare, la migrazione cellulare, la funzione delle cellule staminali e le risposte immunitarie sono stati impiegati per la generazione di organoidi cerebrali fisiologicamente funzionali. Tuttavia, gli attuali approcci alla maturazione richiedono un miglioramento degli organoidi cerebrali altamente raccoglibili e funzionali con variabilità ridotte da lotto a lotto. Qui, dimostriamo due diversi approcci ingegneristici, il bioreattore a microgravità del sistema di coltura cellulare rotante (RCCS) e una piattaforma microfluidica di nuova concezione (piattaforma µ) per migliorare la raccolta, la riproducibilità e la sopravvivenza degli organoidi cerebrali di alta qualità e confrontarli con quelli dei tradizionali sistemi di rotazione e scuotimento. Gli organoidi RCCS e della piattaforma µ hanno raggiunto dimensioni ideali, circa il 95% di raccoglibilità, tempo di coltura prolungato con cellule proliferative, adesive e di tipo endoteliale Ki-67 + /CD31 + /β-catenina+ e hanno mostrato una diversità cellulare arricchita (abbondante neurale/gliale/ popolazione di cellule endoteliali), morfogenesi strutturale del cervello, ulteriori identità neuronali funzionali (neuroni glutammatergici, GABAergici e ippocampali che secernono glutammato) e sinaptogenesi (interazione presinaptica-postsinaptica) durante lo sviluppo dell'intero cervello umano. Entrambi gli organoidi hanno espresso CD11b + /IBA1 + microglia e oligodendrociti MBP + /OLIG2 + ad alti livelli al giorno 60. Gli organoidi RCCS e della piattaforma µ mostrano alti livelli di fedeltà fisiologica un alto livello di fedeltà fisiologica può servire come modelli preclinici funzionali da testare nuovi regimi terapeutici per le malattie neurologiche e trarre vantaggio dal multiplexing.

La comprensione della generazione, della maturazione e dello sviluppo funzionale del cervello è vitale per comprendere lo sviluppo evolutivo del cervello, nonché per sviluppare strategie di trattamento per le malattie neurodegenerative e dello sviluppo neurologico1,2. Sebbene i modelli animali siano utili per l'esame meccanico, la ricapitolazione dello sviluppo del cervello umano è significativamente limitata a causa delle differenze a livello cellulare e molecolare3. Inoltre, gran parte della nostra attuale conoscenza del cervello umano si basa sull’analisi di campioni post-mortem o patologici inappropriati per la manipolazione sperimentale4. Ultimamente, le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), avendo la capacità di rigenerarsi continuamente con fattori di riprogrammazione (OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4) e di differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo, hanno aperto una nuova strada per lo studio dei neuroni umani. sviluppo5. Con il primo protocollo di generazione di organoidi cerebrali 3D derivato da iPSC pubblicato da Lancaster et al.6, gli organoidi cerebrali sono diventati rivoluzionari con la capacità di auto-organizzarsi, formare strutture più complesse, trasformarsi in diverse regioni progenitrici, imitare la composizione del tipo cellulare/tessuto organizzazione del cervello embrionale e assomigliano alla struttura spaziale del cervello7. Inoltre, analogamente al processo di formazione e sviluppo del cervello nel periodo embrionale, gli organoidi cerebrali possono imitare da vicino il cervello umano generando programmi epigenomici e trascrizionali come segnali associati alla diversità cellulare, chiarificazione delle sinapsi funzionali, formazione di spine dendritiche e creazione di reti neuronali autoattivate8,9.

Gli approcci convenzionali alla maturazione degli organoidi cerebrali che utilizzano spinner10 e shaker11 promuovono l'organizzazione auto-neuronale e la formazione di spazi ventricolari cerebrali fornendo agitazione. Tuttavia, questi metodi presentano importanti limitazioni, tra cui la diffusione alterata dei nutrienti e le zone apoptotiche dovute alla mancanza di vascolarizzazione, deficit di cellule immunitarie, dipendenza da matrigel, bassa riproducibilità, scalabilità e alta variabilità dei componenti e delle cellule cerebrali indotte12. Sono state sviluppate diverse strategie per prevenire queste limitazioni, ad esempio mediante la co-coltura con cellule endoteliali vascolari ombelicali umane (HUVEC)13 e cellule endoteliali umane derivate da iPSC non solo per migliorare la diffusione di ossigeno/nutrienti ma anche per sfruttare la differenziazione neurale, la migrazione e la formazione del circuito durante lo sviluppo14. Altre strategie si concentrano sulla ricapitolazione dell'ambiente microfisiologico cellulare con matrice extracellulare cerebrale decellularizzata (ECM)15 o matrice sintetica simile all'ECM per promuovere la differenziazione neurale e gliale durante l'organogenesi cerebrale16,17. Sebbene non completamente risolti, i problemi di bassa riproducibilità, scalabilità e alta variabilità degli organoidi cerebrali sono stati tentati di superare con diverse piattaforme organoidi su chip18,19 o nuovi sistemi di bioreattori come i bioreattori a ruota verticale monouso20. Nonostante il progresso delle tecnologie degli organoidi, le forze emodinamiche come lo stress di taglio, lo stiramento ciclico e la distribuzione dei fluidi che regolano i percorsi meccanosensibili negli organoidi cerebrali non sono ancora chiaramente comprese, il che rappresenta un'altra limitazione critica. Tuttavia, è noto che i segnali meccanosensibili associati al flusso del liquido cerebrospinale durante l'embriogenesi regolano importanti adattamenti strutturali come l'orientamento della forma embrionale con l'effetto dell'asimmetria sinistra-destra, la polarizzazione delle cellule gliali radiali, la differenziazione/funzionalizzazione delle cellule staminali neurali e successivi eventi di piegamento dei tessuti21,22. Pertanto, è necessario sviluppare piattaforme che utilizzino principi biologici e ingegneristici in grado di emulare le dinamiche spaziotemporali e le interazioni cellula-cellula/cellula-ambiente. Qui, analizziamo gli effetti di varie caratteristiche del flusso sia computazionalmente che sperimentalmente sulla maturazione degli organoidi cerebrali e individuiamo la migliore strategia per ingegnerizzare organoidi cerebrali 3D derivati ​​da iPSC a livello molecolare, cellulare e funzionale. La piattaforma microfluidica (piattaforma µ) consente un flusso laminare guidato dalla gravità che imita il flusso del fluido esistente negli spazi cerebrospinali e interstiziali e migliora la diafonia cellula-cellula, l'apporto di ossigeno e lo scambio di nutrienti/rifiuti7,23, portando a organoidi di maggiore durata. Inoltre, le condizioni di microgravità e flusso laminare insolitamente fornite dai bioreattori del sistema di coltura cellulare a rotazione orizzontale (RCCS) mostrano forze idrodinamiche omogenee che facilitano il controllo preciso a lungo termine delle interazioni cellula-cellula e consentono un'elevata raccoglibilità e riproducibilità degli organoidi cerebrali maturati. L'RCCS, ispirato alle condizioni straordinarie delle tecnologie spaziali24, può essere uno strumento unico nella ricerca sugli organoidi grazie alla riduzione dello stress di taglio, all'aumento del trasferimento di massa e alla diminuzione del danno cellulare rispetto ai sistemi tradizionali25. Ipotizziamo che la microgravità e i flussi laminari guidati dalla gravità migliorino la maturazione degli organoidi cerebrali portando a reti spaziali gerarchicamente complesse che riassumono le caratteristiche dello sviluppo corticale embrionale umano.