Trem2 H157Y aumenta la produzione solubile di TREM2 e riduce la patologia amiloide

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Molecular Neurodegeneration

Neurodegenerazione molecolare volume 18, numero articolo: 8 (2023) Citare questo articolo

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Una correzione a questo articolo è stata pubblicata il 28 aprile 2023

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È stato scoperto che la rara variante p.H157Y del TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2) aumenta il rischio di malattia di Alzheimer (AD). Questa mutazione si trova nel sito di scissione del dominio extracellulare TREM2. L'espressione ectopica di TREM2-H157Y nelle cellule HEK293 ha comportato un aumento della perdita di TREM2. Tuttavia, gli esiti fisiologici della mutazione TREM2 H157Y rimangono sconosciuti in assenza e presenza di patologie correlate all'AD.

Abbiamo generato un nuovo modello murino knock-in Trem2 H157Y attraverso la tecnologia CRISPR/Cas9 e studiato gli effetti di Trem2 H157Y sull'elaborazione proteolitica di TREM2, sulla funzione sinaptica e sulle patologie amiloidi correlate all'AD conducendo test biochimici, analisi mirate di spettrometria di massa di TREM2, ippocampo elettrofisiologia, colorazione immunofluorescente, microdialisi in vivo e sequenziamento di RNA in massa corticale.

Coerentemente con precedenti risultati in vitro, Trem2 H157Y aumenta la perdita di TREM2 con elevati livelli solubili di TREM2 nel cervello e nel siero. Inoltre, Trem2 H157Y migliora la plasticità sinaptica senza influenzare la densità e la morfologia microgliale o la segnalazione TREM2. In presenza di patologia amiloide, Trem2 H157Y accelera la clearance dell'amiloide-β (Aβ) e riduce il carico di amiloide, i neuriti distrofici e la gliosi in due linee fondatrici indipendenti. L'analisi di spettrometria di massa mirata di TREM2 ha rivelato rapporti più elevati tra TREM2-H157Y solubile e a lunghezza intera rispetto al TREM2 wild-type, indicando che la mutazione H157Y promuove la perdita di TREM2 in presenza di Aβ. La segnalazione di TREM2 è stata ulteriormente ridotta nei topi omozigoti Trem2 H157Y. La profilazione trascrittomica ha rivelato che Trem2 H157Y sottoregola i geni correlati alla neuroinfiammazione e un modulo immunitario correlato alla patologia amiloide.

Nel loro insieme, i nostri risultati suggeriscono effetti benefici della mutazione Trem2 H157Y nella funzione sinaptica e nell’attenuazione della patologia amiloide. Considerando l'associazione genetica di TREM2 p.H157Y con il rischio di AD, ipotizziamo che TREM2 H157Y negli esseri umani potrebbe aumentare il rischio di AD attraverso un percorso indipendente dall'amiloide, come i suoi effetti sulla tauopatia e sulla neurodegenerazione che meritano ulteriori indagini.

La malattia di Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa cronica caratterizzata dalla deposizione patologica di placche amiloidi extracellulari e grovigli di tau iperfosforilati intraneuronali, nonché da un'importante attivazione della microglia che risponde alla neuropatologia e alla neurodegenerazione [1,2,3]. Molteplici varianti del gene microgliale risultano associate al rischio di AD [4]. Tra questi, la variante p.H157Y del Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2 (TREM2) è stata identificata da un numero relativamente piccolo di portatori e ha conferito un aumento del rischio di AD con un odds ratio (OR) di 11,01 (frequenza allelica minore (MAF) , 0,4%) in una coorte cinese Han [5], mentre in una coorte caucasica utilizzata nell'Alzheimer's Disease Sequencing Project, l'OR era 4,7 (MAF, 0,06%) [6]. Tuttavia, non è chiaro come questa rara variante TREM2 contribuisca al rischio di AD.

TREM2 è un immunorecettore espresso esclusivamente nella microglia del sistema nervoso centrale e nelle cellule mieloidi (ad esempio, macrofagi) nella periferia [7]. È costituito da un dominio di tipo V simile a Ig, una regione del gambo, un dominio transmembrana e una breve coda citoplasmatica [8]. La maggior parte delle varianti di TREM2 a rischio di AD (ad esempio, p.R47H, p.R62H) si trovano nell'esone2 che codifica il dominio simile a Ig [9,10,11]. Queste mutazioni patogene portano nella maggior parte dei casi a un legame inefficiente di ligandi come gli oligomeri di amiloide-β (Aβ) [12,13,14], lipidi anionici fibrillare associati ad Aβ [15], LDL [6, 16], HDL [6] e apolipoproteine [16, 17]. Questi disturbi sono associati alla disfunzione microgliale nella fagocitosi in vitro [16, 18, 19] e al fagocimento della placca amiloide in vivo [20, 21]. Al contrario, la variante p.H157Y si trova nell'esone 3 che codifica per la regione del gambo. Curiosamente, il sito H157-S158 è stato identificato come il sito di scissione ADAM10/17 dove viene prodotto il TREM2 solubile (sTREM2) [22,23,24]. È stato scoperto che l'espressione ectopica di TREM2-H157Y nelle cellule HEK293 aumenta sTREM2 nel mezzo condizionato e riduce il TREM2 maturo a lunghezza intera associato alla membrana [23, 24]. L'aumento della perdita di TREM2 potrebbe essere correlato alla ridotta fagocitosi di pHrodo-E.Coli nelle cellule HEK293 [23] e alla diminuzione dell'attivazione del segnale TREM2 in risposta alla fosfatidilserina nelle cellule T 2B4 [6]. Nonostante queste osservazioni in vitro, le conseguenze in vivo della mutazione TREM2 H157Y rimangono sconosciute.

8 µm [32, 33]) numbers divided by the ROI areas. For IBA1 staining in the non-amyloid mice, a unified intensity threshold was applied to recognize the microglial cell body followed by particle analysis to examine the microglial density and cell body size. To further assess microglial morphology, 4–5 fields were taken per sample under confocal (Zeiss) at 20 × with a zoom factor 0.6. Images were processed to remove background and skeletonized followed by analysis of branch number, junction number and total branch length per microglia [34]./p> 0.25. Hierarchical clustering was performed in MATLAB using the Clustergram function based on standardized Euclidean distance metric. Volcano plots were generated in MATLAB using –log10 (FDR) as y axis and ± log2 (|FC|) as x axis. Pathway analyses of differentially expressed genes were performed through Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/products/ingenuity-pathwayanalysis) [48]./p> 2 suggests moderate preservation and Z summary score > 10 suggests strong preservation./p>

T substitution in exon3 through CRISPR/Cas9 technology to create the missense H157Y mutation (Fig. 1A). Two founders (1 and 2) were obtained with no off-target mutation observed in the offspring from either founder (Fig. S1A-B). Results reported below were generated using the offspring of founder 1 unless otherwise stated. By crossing the Trem2 H157Y heterozygous mice, we obtained three genotypes: wild type (Trem2+/+, referred to as WT), heterozygous (Trem2+/H157Y, referred to as Het), and homozygous (Trem2H157Y/H157Y, referred to as Hom). Littermates of these three genotypes were used to investigate the impacts of the Trem2 H157Y mutation on TREM2 proteolytic processing, microglial density and morphology, synaptic plasticity, and cognitive function./p> T mutation (bold orange) via CRIPR/Cas9. Protospacer region recognized by guide RNA (gRNA) is shown in orange. Protospacer adjacent region (PAM) is indicated in green. B-C. Cortical Trem2 mRNA levels were examined using primers targeting exon 2 (N-terminal, B) or exon 4–5 (C-terminal, C), and normalized to WT mice for each genotype. D. Cycle threshold ratios of C-terminal Trem2 to N-terminal Trem2 (C/N Trem2) were calculated and normalized to WT mice for each genotype. E–F. TREM2 levels were examined by ELISA and normalized to WT mice in cortical TBS (E) and TBSX (F) lysates for each genotype. G-H. TREM2 levels were examined by ELISA in conditioned medium (CM) (G) and RIPA lysates (H) of primary microglia (MG). TREM2 amount was normalized to the total protein level of cell lysates followed by another normalization to WT littermates. N = 8–11 pups per genotype. Unknown sex of each pup. I. Serum TREM2 were examined by ELISA in mice from each genotype. J. SYK, phosphorylated SYK (pSYK) and actin were detected in the RIPA lysates of isolated microglia from WT and Hom mice. K-L. pSYK (K) and SYK (L) were quantified and normalized to WT. M. Ratios of pSYK/SYK were calculated and normalized to the WT mice. B-F, I. N = 11–14 mice per genotype at 6 months of age, mixed sex. Kruskal–Wallis tests with uncorrected Dun's multiple comparisons were used in B-I. J-M. N = 6 mice/genotype at 6 months of age, mixed sex. Unpaired t-tests were used. Data are presented as Mean ± SEM. N.S., not significant. * p < 0.05. **p < 0.01/p>

1.2; FDR< 0.05) were identified and indicated in red or blue in the volcano plot. B. Hierarchical clustering for DEG expression (Hom vs WT) is shown across each sample. DEGs involved in the top 10 pathways (C) are shown in blue. C. Top 10 DEG related pathways were identified through Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Red dashed line indicates the FDR threshold, 0.05. D. Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) identified a unique magenta module which is downregulated in Hom and correlated with amyloid pathological readouts. E. Magenta module eigengenes (ME) were compared between WT and Hom mice. Data are presented as Mean ± SEM. Wilcoxon rank sum test was used. F. Top 10 gene ontology (GO) terms (FDR < 0.05) are shown for the magenta module. G. Network plot of genes involved in the top 10 GO terms was generated through Cytoscape. H. TNF-α in the TBS lysate was quantified and normalized to WT mice for each genotype. N = 19–24 mice per genotype at 8.5 months of age, mixed sex. Data are presented as Mean ± SEM. Kruskal–Wallis tests with uncorrected Dun's multiple comparisons were used. * p < 0.05. **p < 0.01/p>

1.2; FDR<0.05) were identified in the non-amyloid mice. N=5 mice/sex/genotype at 6 months of age. B. No significant modules were identified related to genotype in the non-amyloid cohort. C-G. DEGs, Trem2, Tyrobp, Tmem119, Cx3cr1, and C1q were validated through qPCR in 5xFAD mice. N = 19-24 mice per genotype at 8.5 months of age, mixed sex. Data are presented as Mean±SEM. Kruskal-Wallis tests with uncorrected Dun's multiple comparisons were used. N.S., not significant. * p<0.05. ** p<0.01. *** p<0.001. **** p<0.0001. H. The magenta module identified in amyloid mice was not preserved in the non-amyloid network revealed by a low preservation Zsummary value (<2)./p>

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