Oct 21, 2023
Il ciclo dei trigliceridi consente la modifica degli acidi grassi immagazzinati
Nature Metabolism volume 5,
Nature Metabolism volume 5, pagine 699–709 (2023) Citare questo articolo
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Il ciclo dei trigliceridi è il processo di continua degradazione e risintesi dei trigliceridi nelle riserve cellulari. Mostriamo negli adipociti 3T3-L1 che i trigliceridi sono soggetti a un rapido turnover e riarrangiamento degli acidi grassi con un'emivita stimata di 2-4 ore. Sviluppiamo una tecnologia di tracciamento in grado di seguire simultaneamente e quantitativamente il metabolismo di più acidi grassi per studiare direttamente il ciclo del substrato futile dei trigliceridi e con la risoluzione delle specie molecolari. Il nostro approccio si basa su traccianti di acidi grassi alchinici e spettrometria di massa. Il ciclo dei trigliceridi è collegato alla modifica degli acidi grassi rilasciati mediante allungamento e desaturazione. Attraverso il ciclo e la modificazione, gli acidi grassi saturi vengono lentamente convertiti in acidi grassi monoinsaturi e l'acido linoleico in acido arachidonico. Concludiamo che il ciclo dei trigliceridi rende gli acidi grassi immagazzinati accessibili per l’alterazione metabolica. Il processo complessivo facilita gli aggiustamenti cellulari al pool di acidi grassi immagazzinati per soddisfare le mutevoli esigenze della cellula.
Il ciclo dei trigliceridi/acidi grassi (TG/FA) è il processo di degradazione parziale o completa del grasso immagazzinato per rilasciare FA liberi che successivamente vengono utilizzati per sintetizzare una nuova molecola di TG. Da un lato, può avvenire a livello dell’intero organismo, dove gli FA liberi rilasciati dal tessuto adiposo possono essere riesterificati in TG nel fegato, portando alla ridistribuzione nell’organismo dell’energia immagazzinata1. D'altro canto, avviene anche a livello intracellulare, come un tipico ciclo del substrato “futile” che consuma energia senza una sintesi netta di materiale biologico2. Il ciclismo del substrato intracellulare in generale è una sfida scientifica sia concettualmente che sperimentalmente. Dal punto di vista concettuale, la questione è se gli effetti benefici dei cicli del substrato possano controbilanciare i costi energetici o se il ciclo del substrato sia un’inevitabile imperfezione delle reti complesse. Le prime ricerche sul ciclo TG/FA hanno sottolineato il suo ruolo regolatorio, in particolare nell'adattamento ai rapidi cambiamenti nel consumo di energia3,4, mentre i costi energetici del ciclo erano considerati piccoli5. Negli ultimi anni, tuttavia, un crescente interesse per il ciclo ha avuto origine dall'idea che potrebbe contribuire in modo sostanziale alla termogenesi nel tessuto adiposo6,7. Una migliore comprensione dei percorsi termogenici potrebbe portare a nuove strategie per influenzare la spesa energetica, possibilmente utili nella lotta contro la pandemia globale dell’obesità8,9.
Le limitazioni nella tecnologia sperimentale rappresentano un ostacolo importante per una migliore comprensione del ciclo TG/FA. Quando si utilizza l'etichettatura isotopica convenzionale, la determinazione accurata e diretta della velocità e dei percorsi del ciclismo rappresenta una sfida per il tracciamento metabolico, poiché i prodotti e i prodotti possono diventare indistinguibili già dopo un ciclo di ciclismo (Fig. 1a). Pertanto, i metodi esistenti per studiare il ciclo dei TG/FA sono piuttosto indiretti. Determinazioni raziometriche dell'incorporazione di [3H]FA e [14C]glucosio con determinazione parallela del rilascio di glicerolo10 o strategie simili con isotopi stabili3 hanno fornito informazioni sul grado di esterificazione e riesterificazione di FA da cui si poteva dedurre il ciclismo almeno in termini relativi. Altri metodi utilizzano l'etichettatura [2H]H2O o [18O]H2O. L'arricchimento di questi isotopi in TG ha fornito informazioni sulla sintesi totale e sul turnover di TG11. Tuttavia, manca un esperimento di tracciamento diretto per dimostrare che un pool TG cellulare definito 1 darebbe origine a un nuovo pool 2 riutilizzando gli FA del pool 1, come illustrato in Fig. 1b. Ciò richiederebbe un esperimento di etichettatura con un tracciamento multiparallelo completo di tutte le possibili molecole TG marcate, il che rappresenta un’enorme sfida tecnica. Abbiamo recentemente sviluppato una tecnologia di tracciamento basata su FA marcati con alchini con reporter di chimica del clic e spettrometria di massa (MS)12,13. Combina tutte le caratteristiche necessarie per lo studio del ciclo TG/FA: elevata sensibilità, specificità inequivocabile e, in particolare, facile discriminazione delle specie lipidiche monomarcate e multimarcate12.
200 species. Over the chase period, we found a massive increase in single-labelled TG;Y1 species, in particular those containing long-chain FA;Ys (Fig. 4a), with a concomitant strong decrease of all three FA;Ys in double- and triple-labelled TG;Yn species (Fig. 4b,c). This behaviour can also directly be seen in the original spectra that visualize the alkyne-labelled neutral lipids by their neutral loss (NL) of 73.1 m/z (Extended Data Fig. 5). The kinetics of these decreases were different for double- and triple-labelled TG;Yn species. After 6 h, 46.7 ± 4.1% of the initial TG;Y2 was still present (Fig. 4b), in contrast to 36.5 ± 3.5% of the initial TG;Y3 (Fig. 4c). Regarding the decrease in TG;Y3, there was very little relative difference between the three input FA;Ys; regarding TG;Y2, the medium-chain FA;Y decreased slightly faster (residual amount after 6 h: FA 11:0;Y, 44.0%; FA 16:0;Y, 47.6%; FA 18:2;Y, 49.0%) than the two long-chain tracers. For all three FA;Ys together, the data were plotted as the fraction of total FA;Y that is found in TG;Y1, TG;Y2 and TG;Y3 (Fig. 4d). They demonstrate the re-distribution of FA;Y from triple- and double-labelled species towards single-labelled TG;Y1. TG cycling is the only consistent explanation for this observation. The most simple cycle would consist of TG hydrolysis yielding DG + FA and subsequent re-acylation to TG (Fig. 4e). The top row shows the situation after the 1-h labelling period. During the pulse labelling, the input FA;Ys (red) are a major fraction of the total FA that is used for TG synthesis, resulting in a large fraction of multi-labelled TG species. In numbers, the labelled TG;Yn pool contained 94 pmol of TG;Y3, 1,017 pmol of TG;Y2 and 3,030 pmol of TG;Y1 at the end of the pulse, provided as black numbers above the top symbols (Fig. 4e). Further, there is the unlabelled pool of endogenous TG of 138,000 ± 7,000 pmol, as obtained from lipidomics of unlabelled TG in the same samples. Following a theoretical binominal equilibration, the dilution of label can be calculated (blue numbers) for one complete TG → DG → TG cycle, predicting a 55% decrease of TG;Y2 and a 45% increase in TG;Y1, which is close to the situation at the 6-h chase time. Figure 4f shows an alternative way of representing the data. The lines represent the theoretical binominal distribution of total FA;Y over the three classes of TG;Yn, as a function of the fraction of FA;Y in the total FA of the TG pool. For each of the four experimental time points, we now determined the position of the data along the x axis that would best fit a binominal distribution. For the pulse alone, this results in a total fraction of FA;Y in total synthesized TG;Yn of 26%. This number indicates that during the labelling period, the labelled FA;Y contributed 26% of all FAs that were acylated to TG. In the absence of TG cycling, the relative amounts of the three labelled TG;Yn species would stay constant over time. However, the experimental data indicate that, with increasing chase time, the labelled FA;Y spreads from the small original pool to increasing pool sizes corresponding to 12%, 5% and 3.5% label content. This cycling-dilution process also explains why TG;Y3 disappeared faster than TG;Y2. Unless TG-degrading enzymes could sense the number of triple bonds in a TG species, for which there is no indication so far, both TG;Y2 and TG;Y3 would be degraded at the same rate. The apparent differences in the degradation kinetics are due to the different statistics of the re-acylation of DG;Y1 and DG;Y2 to TG;Y2 and TG;Y3, respectively. Quantitatively, these data indicated that the 6-h chase time corresponded to about 1.5 t1/2, suggesting a t1/2 of about 4 h. We next asked whether the observed cycling depends on a specific FA label combination and whether the alkyne label as such might be the cause of the cycling phenomenon (Fig. 4g–j). Therefore, we performed a pulse-chase experiment as described above, but with different FA combinations, that is, FA 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y (Fig. 4g) or FA 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y (Fig. 4i). The FA 19:1;Y has previously been used in hepatocytes12,13 and is a good analogue of oleic acid. The latter FA combination is a close mimic of the natural FA composition of the cells under study regarding chain length and double bond count (see Supplementary Table 1 for a detailed analysis of average C-atom and double bond numbers for the labelling experiments shown in Fig. 4g–j). Comparison of data from both FA combinations (Fig. 4g,i) shows that the cycling is independent of the presence of a medium-chain FA and takes place with very similar kinetics. Please note that these experiments have a higher kinetic time resolution and confirm the kinetics of the previous experiment. We also performed analogous pulse-chase experiments using isotope-labelled FA rather than alkyne-labelled FA. Combinations were FA 11:0[D3]/16:0[13C16]/18:2[13C18] (Fig. 4h) and FA 16:0[13C16]/18:2[13C18]/19:1[D8] (Fig. 4j). The analysis of isotope-labelled samples is demanding because isotope labelling lacks the superior analytical sensitivity and specificity hallmarking the alkyne tracers. As an illustration, Extended Data Figs. 6 and 7 show a comparison of primary spectra from the experiments in Fig. 4g,h. Alkyne-labelled TG species separate well from the bulk of unlabelled material (Extended Data Fig. 6a,b), and closer inspection indicates that the major labelled species are the same as the dominant endogenous species (see annotated spectrum in Supplementary Spectrum 1). In contrast, it is unavoidable that the isotope-labelled TGs become part of the crowded region of m/z 700–900 (Extended Data Fig. 7a). At least the peak of the dominant labelled TG 43:1 could be directly identified in the mixture, but the other species were not visually identifiable. An equivalent of the NL73 search for alkyne-labelled species does not exist for the isotope-labelled species, but the TGs that contained the labelled FA 11:0[D3] could be identified using an NL search for the loss of that FA together with ammonia, that is, at NL m/z 206.2. Such analysis was performed (Extended Data Fig. 7b) and yielded a reasonable spectrum. An equivalent LipidXplorer search algorithm was then used to identify and quantify the labelled TGs. Corresponding searches were also performed for the other isotope-labelled FAs. Although this is necessary to achieve the required specificity, it means that each group of isotope-labelled TGs is quantified by a different neutral loss, in contrast to the uniform quantification of the alkyne-labelled species, introducing a possible quantitative bias in the data. Finally, we could identify 105 isotope-labelled TG species (versus 270 alkyne-labelled TG species), just enough for calculations for single-, double- and triple-labelled TGs (Fig. 4h,j). These data showed that TG cycling takes place in the same way and with comparable kinetics for isotope- and alkyne-labelled species./p>
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