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Oct 27, 2023

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Nature Biomedical Engineering

Nature Biomedical Engineering (2023) Citare questo articolo

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Durante l'intervento chirurgico, una diagnosi istopatologica rapida e accurata è essenziale per il processo decisionale clinico. Tuttavia, il metodo prevalente di consultazione intraoperatoria della patologia è impegnativo in termini di tempo, manodopera e costi e richiede l'esperienza di patologi addestrati. Qui mostriamo che i campioni bioptici possono essere analizzati entro 30 minuti valutando sequenzialmente i fenotipi fisici delle cellule sospese singolarizzate dissociate dai tessuti. Il metodo diagnostico combina la dissociazione meccanica priva di enzimi dei tessuti, la citometria di deformabilità in tempo reale a velocità di 100-1.000 cellule s−1 e l'analisi dei dati mediante riduzione della dimensionalità non supervisionata e regressione logistica. I parametri del fenotipo fisico estratti dalle immagini in campo chiaro di singole cellule hanno distinto le sottopopolazioni cellulari in vari tessuti, migliorando o addirittura sostituendo le misurazioni dei marcatori molecolari. Abbiamo utilizzato il metodo per quantificare il grado di infiammazione del colon e per discriminare accuratamente il tessuto sano e quello tumorale in campioni bioptici di colon murino e umano. Questo approccio rapido e senza etichetta può aiutare il rilevamento intraoperatorio di cambiamenti patologici nelle biopsie solide.

I cambiamenti nelle proprietà fisiche delle cellule, come la dimensione, la forma o la deformabilità delle cellule, sono fondamentali per la patologia di alcune malattie e hanno un grande potenziale come marcatore diagnostico o prognostico1,2. Negli ultimi decenni sono stati sviluppati numerosi strumenti per esaminare le proprietà meccaniche delle cellule, tra cui l'aspirazione con micropipette, la microscopia a forza atomica, la reometria delle microsfere e le trappole ottiche3,4. In questo campo si è assistito a un aumento esponenziale delle pubblicazioni che suggeriscono una forte correlazione tra il fenotipo meccanico cellulare e lo stato patologico, tra cui sepsi5,6, malaria7, diabete8, anemia falciforme9 e cancro10,11,12. Sfortunatamente, queste tecniche convenzionali soffrono di una bassa produttività delle cellule e richiedono una profonda conoscenza specialistica per il funzionamento, il che ne limita l'uso come strumento diagnostico. La citometria a fluorescenza e deformabilità in tempo reale (RT–FDC)13,14 è una delle numerose nuove tecniche microfluidiche10,15,16,17,18,19,20,21,22 che hanno superato questi inconvenienti, consentendo la valutazione delle proprietà fisiche di singole cellule in modo senza etichetta e ad alta produttività, aprendo una nuova strada alla diagnostica clinica. RT-FDC non è solo veloce (con un massimo di 1.000 cellule analizzate al secondo), ma oltre alla deformabilità cellulare fornisce anche informazioni multidimensionali ottenute direttamente dalle immagini cellulari. Il potenziale diagnostico della RT-FDC è stato dimostrato in molte condizioni patologiche umane che vanno dalla leucemia alle infezioni batteriche e virali, inclusa la malattia da coronavirus 2019 (rif. 23,24,25,26,27). Tuttavia, fino ad ora, l’applicabilità della tecnica era limitata all’analisi di cellule in coltura o biopsie liquide da sangue o midollo osseo.

La biopsia dei tessuti solidi è il metodo più comune per caratterizzare la neoplasia ed è fondamentale nel guidare i chirurghi durante la gestione intraoperatoria e perioperatoria dei pazienti affetti da cancro. La valutazione diagnostica delle biopsie di tessuto solido viene comunemente fornita attraverso la consultazione patologica intraoperatoria, che si basa sull'analisi istopatologica delle sezioni bioptiche congelate28. Il flusso di lavoro convenzionale della diagnosi intraoperatoria prevede numerose fasi di lavorazione, reagenti per la colorazione e l'ispezione microscopica di fette di tessuto da parte di patologi esperti per l'analisi esperta. Inoltre, la preparazione del campione richiede molto tempo, risorse e manodopera. Sono stati proposti flussi di lavoro alternativi28, tra cui la spettroscopia Raman stimolata29,30, la tomografia a coerenza ottica31 e la microscopia a fluorescenza32,33, ma non sono stati ancora implementati. La necessità di un approccio che riduca la preparazione del campione e il tempo necessario alla diagnosi è quindi imminente.

In questo articolo presentiamo un metodo diagnostico rapido e senza etichetta per le biopsie di tessuti solidi. L'approccio combina la dissociazione meccanica e priva di enzimi dei tessuti utilizzando un trituratore di tessuti (TG) per l'isolamento rapido e semplice di singole cellule vitali34,35 con la valutazione sequenziale dei fenotipi fisici cellulari di migliaia di singole cellule utilizzando RT-FDC. Innanzitutto, esaminiamo un pannello di diversi tessuti di topo e valutiamo la resa cellulare, la vitalità e la fattibilità della misurazione RT-FDC in seguito alla dissociazione meccanica del tessuto. Illustriamo la capacità di distinguere sottopopolazioni di cellule tissutali esclusivamente sulla base dei parametri fisici derivati ​​​​dall'immagine senza conoscenze preliminari o etichettatura molecolare aggiuntiva, che può migliorare la citometria a flusso convenzionale, che si basa su pannelli multicolori di marcatori per identificare le cellule. Mostriamo anche che il nostro approccio può determinare cambiamenti infiammatori nel tessuto del colon, sulla base della misurazione della deformabilità cellulare nel sistema microfluidico. Inoltre, esaminiamo campioni bioptici congelati e freschi di topo e colon umano e mostriamo che RT-FDC può distinguere i tessuti sani da quelli cancerosi, utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA) e l'apprendimento automatico sui dati multidimensionali. I risultati dimostrano che la valutazione del fenotipo fisico delle singole cellule derivate dai tessuti utilizzando RT-FDC è una strategia alternativa per rilevare uno stato infiammatorio o maligno. La nostra procedura, che può fornire risultati entro 30 minuti, ha il potenziale come pipeline diagnostica intraoperatoria per rilevare in modo sensibile i cambiamenti patologici nelle biopsie e, più in generale, per identificare e caratterizzare le popolazioni cellulari nei tessuti in modo imparziale e privo di marcatori.