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L'ablazione RASA2 nelle cellule T aumenta la sensibilità all'antigene e prolunga la durata

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Oct 25, 2023

L'ablazione RASA2 nelle cellule T aumenta la sensibilità all'antigene e prolunga la durata

Nature volume 609, pages

Natura volume 609, pagine 174–182 (2022)Citare questo articolo

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18 citazioni

303 Altmetrico

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L'efficacia delle terapie adottive con cellule T per il trattamento del cancro può essere limitata da segnali soppressivi provenienti sia da fattori estrinseci che da checkpoint inibitori intrinseci1,2. L’editing genetico mirato ha il potenziale per superare queste limitazioni e migliorare la funzione terapeutica delle cellule T3,4,5,6,7,8,9,10. Qui abbiamo eseguito più screening knock-out CRISPR sull'intero genoma in diverse condizioni immunosoppressive per identificare i geni che possono essere presi di mira per prevenire la disfunzione delle cellule T. Questi schermi convergevano su RASA2, una proteina RAS che attiva la GTPasi (RasGAP) che identifichiamo come punto di controllo del segnale nelle cellule T umane, che viene sottoregolato in seguito alla stimolazione acuta del recettore delle cellule T e può aumentare gradualmente con l'esposizione cronica all'antigene. L'ablazione RASA2 ha potenziato la segnalazione MAPK e l'attività citolitica delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) in risposta all'antigene bersaglio. Stimolazioni ripetute dell'antigene tumorale in vitro hanno rivelato che le cellule T carenti di RASA2 mostrano una maggiore attivazione, produzione di citochine e attività metabolica rispetto alle cellule di controllo e mostrano un netto vantaggio nell'uccisione persistente delle cellule tumorali. Le cellule T CAR RASA2-knockout avevano un vantaggio competitivo in termini di fitness rispetto alle cellule di controllo nel midollo osseo in un modello murino di leucemia. L’ablazione di RASA2 in molteplici modelli preclinici di terapie con recettori delle cellule T e cellule CAR T ha prolungato la sopravvivenza nei topi xenotrapiantati con tumori liquidi o solidi. Insieme, i nostri risultati evidenziano RASA2 come un obiettivo promettente per migliorare sia la persistenza che la funzione effettrice nelle terapie con cellule T per il trattamento del cancro.

Le cellule T CAR hanno avuto un ruolo trasformativo in un sottogruppo di tumori maligni ematologici aggressivi, mentre le cellule T transgeniche con il recettore delle cellule T (TCR) (cellule T TCR) hanno mostrato risultati promettenti negli studi clinici in fase iniziale per i tumori solidi1. Tuttavia, molti tumori, in particolare i tumori solidi, non rispondono alle attuali terapie con cellule T o progrediscono rapidamente dopo la risposta iniziale. All'interno della massa tumorale, il microambiente immunosoppressivo rappresenta una barriera sostanziale all'efficacia dell'immunità antitumorale2,11. Inoltre, l'esposizione persistente all'antigene può portare alla disfunzione delle cellule T, evidenziando la necessità di bilanciare la funzione effettrice e la persistenza a lungo termine nelle cellule T ingegnerizzate3,12. La manipolazione mirata di geni selezionati viene testata come strategia per aumentare l'efficacia delle terapie adottive con cellule T5,6,7. Tuttavia, i target genetici ottimali nelle cellule T umane non sono stati esplorati sistematicamente. Gli schermi CRISPR su larga scala possono accelerare la scoperta di perturbazioni genetiche che possono aumentare l’efficacia delle cellule T ingegnerizzate3,8,9,10. In precedenza abbiamo sviluppato una piattaforma di scoperta nelle cellule T umane primarie e l'abbiamo applicata per identificare nuovi regolatori genetici della proliferazione delle cellule T13. Qui descriviamo screening genetici imparziali eseguiti in diverse condizioni immunosoppressive comunemente riscontrate nel microambiente tumorale (TME) che hanno scoperto l'ablazione del gene RASA2 come strategia per le cellule T per superare molteplici segnali inibitori. Troviamo che l'ablazione di RASA2 aumenta la sensibilità all'antigene e migliora sia la funzione effettrice che la persistenza delle cellule T CAR e TCR. Infine, mostriamo che l’ablazione con RASA2 nelle cellule T antigene-specifiche può migliorare il controllo del tumore ed estendere la sopravvivenza in molteplici modelli preclinici di tumori liquidi e solidi.

I checkpoint intrinseci soppressivi della TME e delle cellule T possono compromettere l'efficacia delle cellule T ingegnerizzate che colpiscono i tumori solidi14. Abbiamo sviluppato un approccio sistematico per identificare le perturbazioni genetiche che potrebbero rendere le cellule T resistenti a una serie di segnali inibitori incontrati nella TME. In precedenza abbiamo utilizzato CGS-21680, un agonista dell'adenosina13, per simulare un segnale inibitorio elevato dell'adenosina A2A in risposta ad alti livelli di adenosina nella TME15 ipossica. Qui abbiamo esteso questa strategia per modellare molteplici sfide alla funzione delle cellule T nella TME. Per modellare i segnali dei checkpoint intrinseci, ci siamo concentrati sugli inibitori della segnalazione del calcio e della calcineurina (tacrolimus e ciclosporina), che è un percorso critico per l'attivazione delle cellule T che viene spesso soppresso nelle cellule T infiltranti il ​​tumore16. Per imitare un prominente segnale inibitorio estrinseco nella TME, abbiamo utilizzato il TGFβ, una citochina soppressiva canonica che limita la funzione delle cellule T all'interno dei tumori17. Infine, poiché le cellule T regolatorie (cellule Treg) sono importanti mediatori della disfunzione delle cellule T in diversi tipi di tumore18, abbiamo adattato la nostra piattaforma di screening per analizzare le interazioni cellula-cellula e quindi rivelare geni che conferiscono resistenza alla soppressione delle cellule T effettrici da parte delle cellule Treg.

1.5) between 5 (blue) and all 6 (pink) of the screens are labelled. Bar height is the number of shared genes among the screens, connected by dots in the lower panel (n = 4 human donors for stimulated (stim) and Treg cell screens, n = 2 for adenosine, cyclosporine and tacrolimus, and n = 1 for the TGFβ screen). c,d, log2 fold change (FC) for individual guide RNAs (vertical lines); background shows the overall guide distribution in greyscale. c, Guides targeting RASA2 (pink) across all suppressive conditions. d, Guides targeting RasGAP family members other than RASA2 were not enriched consistently in either direction, whereas guides targeting the RasGEF RASGRP1 were depleted from dividing cells as expected. e, Distribution of CFSE staining in RASA2-KO versus control (Ctrl; non-targeting guide RNA) T cells across all suppressive conditions. f, Cancer cell growth during in vitro cancer cell-killing assay under suppressive conditions. AUC, area under the growth curve. n = 2 donors in triplicate, shape denotes donor. g, Suppression assay confirms that RASA2 ablation rendered T cells resistant to Treg cell suppression of proliferation in vitro. Bars show the CD8+ cell count 4 days after stimulation (n = 4 donors per group; mean ± s.e.m.; **P < 0.01 and ***P < 0.001, two-sided paired Student's t-test). h, RASA2 ablation rendered T cells resistant to Treg cell suppression compared with control T cells in an in vitro cancer cell-killing assay for one representative donor out of four (summary statistics shown in Extended Data Fig. 2g). Line is the mean and shaded area is 95% confidence interval for 3 technical replicates./p>1.54) were defined as hits for the shared hits analysis to generate Fig. 1b and Extended Data Fig. 1c and are detailed in Supplementary Table 1. To define suppressive condition-specific hits, the sgRNA counts in CFSE-low (highly dividing) cells were compared to the stimulation only (stim) condition using MAGeCK software as above. Results of this analysis are provided in Supplementary Table 2. For the quality metric of screens by dropout analysis of essential genes, we used essential genes as determined by DepMap19 and GSEA for gene-level log2 fold change. For analysis of expression of screen hits in primary human T cells the DICE database was used, averaging the expression of both activated CD4+ and CD8+ T cells20./p>1010 photons s–1 or when mice demonstrated signs of distress described in our IACUC protocol such as respiratory distress, hunched posture, lesions unresponsive to treatment, 15–20% weight loss, impaired or decreased mobility, neurologic signs that interfere with normal function or reduced grooming. These limits were not exceeded in any of the experiments. Mice were injected intraperitoneally with 1 × 106 LM7-GFP-ffluc osteosarcoma tumour cells. Seven days later, mice were injected intraperitoneally with 1 × 105 CAR T cells. The experiment was performed twice with CAR T cells generated from two different healthy donors. For the second experiment, mice that had long-term tumour-free survival (n = 1 for control KO, n = 3 for RASA2 KO) were re-challenged with an intraperitoneal injection of 1 × 106 LM7-GFP-ffluc tumor cells at day 174. Tumour burden was monitored by bioluminescence imaging as above./p> 1.5, methods) across the screen conditions (x-axis) including hits unique to each individual screen. Shared hits for each subset are detailed in Supplementary Table 1. d, Heatmap of the pairwise Pearson's correlation coefficient for gene-level z-scores for all screen conditions. e, Volcano plots showing p-value (MAGeCK RRA one-sided test and methods) on the y-axis and gene-level z-scores on the x-axis, comparing highly dividing cells in each suppressive condition to highly dividing in the vehicle condition. Highlighted are genes found to be specific to adenosine and TGFβ screens, selected for further validation. f, Gene targets from screens were selected as either general (PAN) or more specific to certain suppressive contexts and were knocked out individually in T cells. CFSE stained, Cas9 RNP-electroporated edited T cells were stimulated and cultured in the different suppressive conditions. Percent of cells proliferating for each gene KO compared to control cells are displayed for each suppressive condition (n = 2 donors, 2 sgRNAs per gene target in triplicates. We highlighted gene KOs found to confer significant resistance in predicted conditions (adenosine, TGFB, and calcium/calcineurin inhibitors – Tacrolimus, and Cyclosporine), using a cut-off of FDR adjusted p-value < 0.05. For clarity, displayed are the significant p-values for gene targets according to their suppressive screen condition of origin, but results for all genes across conditions are detailed in Supplementary Table 3). As expected, ADORA2A, TGFBR1 and TGFBR2, FKBP1A, and PPIA KOs conferred resistance in the adenosine, TGFB, Tacrolimus, and Cyclosporine conditions, respectively. PDE4C and NKX2-6 KOs were found to confer relatively selective resistance in the adenosine condition, and NFKB2 KO was found to increase resistance in the calcineurin inhibitor (tacrolimus and cyclosporine) conditions. TMEM222, while scoring very highly in the screens, did not increase proliferative advantage in this arrayed validation (dots are individuals replicates, black vertical lines are the mean, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 and ***p < 0.0001 for two-sided unpaired Student's t-test). g, Log fold change (LFC) of guides targeting RasGAP genes or the RasGEF RASGRP1, across the different suppressive screen conditions shown here. h, Expression levels (scaled to minimum of 0 and a maximum of 1) of the RasGAP family members available in the BioGPS dataset27, including RASA2, across healthy human tissues revealed RASA2 as selectively expressed in CD8+/4+ human T cells. Data also shown for RASGRP1, a RasGEF with defined roles in TCR signaling and an expression pattern strikingly similar to that of RASA2./p>

1, as determined by DESeq2 analysis (methods). c, d Gene set enrichment analysis (GSEA) of oxidative phosphorylation (c) and glycolysis (d) ranked genes, based on DESeq2, higher rank indicates enrichment in RASA2 KO over CTRL. p-value is shown as determined by a two-sided permutation-test. Top up-regulated genes in each enrichment are listed to the right of each panel e, GSEA of oxidative phosphorylation genes correlated with RASA2 expression in immune cells in the GEO expression database, as retrieved by correlationAnalyzeR (methods). Genes are ranked by the Pearson correlation coefficients between RASA2 and the query gene, p-value by two-sided permutation test, after FDR adjustment. f, Selected examples of expression of RASA2 and two mitochondrial fitness genes, MRPL27 (left panel) and MRPL14 (right panel) across GEO datasets from immune cells. Shown at the top is the Pearson's correlation coefficient (R) and FDR adjusted p-value (padj) for each scatter plot. Values represent expression after variance stabilizing transformation (VST). g, Expression of RASA2 in stimulated T cells compared to unstimulated T cells, as measured by published single-cell RNA-Seq dataset, for two human donors13. h, i, Expression of Rasa2 compared to Pdcd1 in published RNA-Seq datasets from models of T cell exhaustion in murine T cells. Expression was scaled for a maximum of 1 and a minimum of 0 for each gene in each dataset (For LCMV samples in (h): n = 2 mice for Naive group, n = 3 mice for exhaustion group; for OVA samples, error bars are mean ± SEM (i): n = 3 mice for all groups, error bars are mean ± SEM). j, Log fold change (LFC) values for RASA2 sgRNAs in CRISPRa and CRISPRi screens for cytokine production42 (MAGeCK's gene-level FDR listed for RASA2 in each screen). k, Western blot for level of RASA2 expression following RASA2 transgene or control (CTRL) transduction in two T cell donors. l, Normalized values for T cell expansion based on cell counts for T cells with RASA2 transgene versus GFP control (n = 3 human T cell donors, mean ± SEM, shape denotes donor). m, histogram for one example donor from cells described in (l), stained and FACS analyzed for CD69 activation marker. n, Summary data for CD69 levels in two T cell donors transduced with the RASA2 transgene versus control (n = 2 human T cell donors, shape denotes donor)./p>

 0.05 for two-sided Wilcoxon test, shape denotes donor)./p>